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【摘要】 目的 采用DEAE-Sephadex A-50纯化,提高破伤风抗毒素免疫球蛋白F(ab’)2的纯度。方法 破伤风免疫血浆用胃蛋白酶消化、硫酸铵盐析、明矾提纯后的免疫球蛋白F(ab’)2 ,经DEAE-Sephadex A-50纯化并进行检测。结果 经上述方法消化2h,95%以上的IgG水解成为F(ab’)2 ,经DEAE-Sephadex A-50纯化后破伤风抗毒素免疫球蛋白F(ab’)2含量可达75%以上,比活性大幅度提高。结论 DEAE-Sephadex A-50纯化破伤风抗毒素免疫球蛋白F(ab’)2是一个较为理想的方法。
【关键词】 破伤风抗毒素 F(ab’)2 纯化 DEAE-Sephadex A-50
Study on TAT immunoglobulin F(ab’)2 purified by DEAE-Sephadex A-50
ZHANG Jin，WEI Guo-hong，ZHANG Lin.Lanzhou Institute of Biological Products,Lanzhou 730046,China
【Abstract】 Objectives In order to improve the purity of TAT immunoglobulin F(ab’)2,we purified it by DEAE-Sephadex A-50.Methods The immunoglobulin F(ab’)2,produced from the tetanus immune plasma which was digested by pepsin,separated by ammonium sulphate,purified by alum,was purified by DEAE-Sephadex A-50 and was carried on all reqired tests.Results After digestion for 2 hours in mentioned situation,over 95%IgG hydrolysis F(ab’)2,and after purification by DEAE-Sephadex A-50,the content of F(ab’)2 reached over 75%,and the specific activity increased greatly.Conclusion Purification of TAT immunoglobulin F(ab’)2 by DEAE-Sephadex A-50 is an ideal method.
【Key words】 tetanus antitoxin(TAT); F(ab’)2;purification;DEAE-Sephadex A-50
近年来层析技术已广泛应用于生物高分子的分离和纯化，据报道，国内外一些生物制品厂家采用层析技术进行血浆蛋白分离、疫苗纯化［1］。破伤风抗毒素目前采用盐析法生产的产品存在杂蛋白含量偏高，特别是胃蛋白酶消化后制品中Fc片段无法彻底去除，产品的比活性和F(ab’)2含量偏低,临床使用时个别会出现副反应；为进一步提高制品的纯度，笔者采用了DEAE-Sephadex A-50纯化经胃蛋白酶消化、硫酸铵盐析、明矾提纯的破伤风抗毒素，将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 DEAE-Sephadex A-50, 购自瑞典Pharmacia公司；胃蛋白酶, 购自德国MERCK公司；破伤风抗毒素制品由本所血清室提供；破伤风抗毒素标准品（批号0053，效价为6.0 IU/ml）购自中国药品生物制品检定所；试验用昆明小鼠清洁级、英国豚鼠清洁级由本所实验动物室提供。
1.2 方法
1.2.1 DEAE-Sephadex A-50预处理 称取DEAE-Sephadex A-50 100g，悬于10000 ml注射用水中，1h后倾去上层细粒，按每克A-50加0.5N NaOH 15ml的比例，将A-50浸泡于0.5N NaOH中，搅匀，静置30min，装入布氏漏斗（垫有2层尼龙绢丝）中抽滤，并反复用注射用水洗至pH显中性；再以0.5N HCl同上操作过程处理，最后以0.5N NaOH再处理一次；处理完后将A-50浸泡于0.1M,pH7.4 PBS中过夜。
1.2.2 纯化 将已预处理的A-50用布氏漏斗抽干，称重。按比例加入经胃蛋白酶消化、硫酸铵盐析、明矾提纯的破伤风抗毒素免疫球蛋白F(ab’)2制品中缓慢搅拌，搅拌结束装入布氏漏斗（垫有2层尼龙绢丝）滤去A-50凝胶。A-50凝胶用不同浓度的NaCl溶液洗涤和洗脱。纯化前后制品进行检测。
1.2.3 检测方法 破伤风抗毒素的热原质、蛋白含量、小鼠中和效力试验、NaCl含量、F(ab’)2含量、无菌检查、鉴别试验等项目均按文献［2］进行。
1.2.4 安全试验
1.2.4.1 小鼠试验法 上述方法纯化的3批破伤风抗毒素分别接种体重18～22g。每只小鼠腹腔注射供试品0.5ml，观察7天。观察期内，小鼠应全部健存，且无异常反应，到期时每只小鼠体重应增加，供试品判为合格。
1.2.4.2 豚鼠试验法 每批供试品用2只豚鼠，注射前每只豚鼠称体重，应250～350g。每只豚鼠腹腔注射供试品5.0ml，观察7天，观察期内，豚鼠应全部健存，且无异常反应，到期时每只豚鼠体重应增加，供试品判定为合格［2］。
1.2.5 统计学分析 采用SPSS 11.5版医学统计分析软件进行分析。
2 结果
2.1 纯化前后热原质试验结果比较 按照以上方法分别对三批（050701、050702、050703）破伤风抗毒素制品进行了小量纯化试验。纯化前后检测结果见表1，由表1可见纯化后三批热原质总和平均降低0.06℃，经过DEAE-Sephadex A-50纯化后三批制品热原质均符合要求。表1 纯化前后破伤风抗毒素试验结果比较
2.2 纯化前后蛋白含量、比活性结果比较 纯化前后蛋白含量结果比较，纯化后比纯化前蛋白含量降低分别为10.43%、13.96%、26.92%，三批试验平均降低17.1%；纯化前后蛋白含量两组检测数据经统计学方差分析P=0.019, P<0.05, 差异有显著性。纯化后比纯化前比活性分别提高11.73%、16.22%、36.82%。纯化前后比活性两组结果采用上述软件进行方差分析P=0.022, P<0.05, 差异有显著性。
DEAE-Sephadex A-50纯化破伤风抗毒素免疫球蛋白F(ab’)2是一个较为理想的方法。
2.3 纯化前后F(ab’)2含量结果比较 纯化前后F(ab’)2含量结果采用上述软件进行方差分析P=0.01, P<0.05, 差异有显著性。
2.4 安全试验结果 7天观察期内，各组小鼠全部健存，动作活泼，表现如常，每只小鼠体重有增加，且无异常反应；7天观察期内，各组豚鼠全部健存，动作活泼，表现如常，每只豚鼠体重都有增加，且无异常反应，表明纯化的破伤风抗毒素安全性好。
以上试验结果表明，破伤风抗毒素经DEAE-Sephadex A-50纯化后，制品的各项指标均达到药典三部要求，蛋白含量平均降低17.1%，F(ab’)2含量平均提高22.65%，比活性平均提高21.59%，总效价回收率95.3%，进一步改善了制品的外观，提高了制品质量。
2.5 结论 DEAE-Sephadex A-50纯化破伤风抗毒素免疫球蛋白F(ab’)2是一个较为理想的方法。
3 讨论
DEAE-Sephadex A-50 为弱酸性阴离子交换剂，经NaOH将Cl-型转变为OH-型后，可纯化酸性蛋白，胃蛋白酶消化中除F(ab’)2外其余均属酸性蛋白。当溶液的pH在6.5时，酸性蛋白被DEAE-Sephadex A-50吸附，有效成分F(ab’)2留在溶液中。因此利用这一原理可以提高F(ab’)2含量。
在选择A-50吸附用量时，我们考虑的基点是以最小的A-50用量使破伤风抗毒素的回收率和纯度均达到较理想的结果，从而尽量降低因A-50吸附而造成的制品损失。所以我们选择了1：2（凝胶干重﹕蛋白克数）这一比例。
纯化前后的F(ab’)2含量和效价测定分析，F(ab’)2含量提高主要是因去除了杂蛋白所致，总效价回收率由纯化工艺引起的损失为4.7%。
针对片段抗体极易发生降解或聚合，加之酶切产物成分复杂，给纯化工作带来许多困难，对建立的工艺在保证达到指定纯度的前提下，应尽可能地做到操作步骤少，工艺流程短，以最大限度地保持其生物活性，减少片段在酶切及纯化过程中降解或聚合的可能性［3］。
【参考文献】
1 刘隽湘. 输血疗法与血液制剂.北京：人民卫生出版社,1996,196-208.
2 国家药典委员会编.中华人民共和国药典三部.北京：化学工业出版社, 2005,139-140.
3 余晓玲, 米力, 陈志南,等. 片段抗体纯化工艺的优化.生物技术通讯,2000,11(2): 123-124.
作者单位：730046 甘肃兰州,兰州生物制品研究所