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【摘要】 目的 应用流式细胞术检测外周血白细胞HLA-B27，并结合临床诊断，寻求诊断强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)的最适合临界值。方法 应用美国Beeton Dickinson公司流式细胞仪检测95例AS患者、226例非AS(包括腰腿背痛患者87例，其他SPA患者62例，类风湿性关节炎43例，风湿性关节炎34例)患者及50例健康体检者的外周血HIA-B27表达强度。结果 以美国BD公司试剂设定的界值≥荧光强度147道数为准，仅58例AS患者(61.05％)HLA-B27阳性，其中有17例检测值在140～146道数之间；非AS组中，HLA-B27阳性11例(4．87％)；健康对照组HLA-B27阳性3例(6．00％)。结论 以进口试剂盒设置的临界值为准,AS组阳性率过低，与临床不符，影响一部分AS患者的早期诊断。如降低其临界值，提高流式细胞术检测HLA-B27抗原的阳性率，更符合临床诊断,有利于AS患者的诊断和治疗。
【关键词】 HLA-B27；流式细胞术；强直性脊柱炎；临界值
The settting of flow cytometer assay critical value for HLA-B27 in patients with ankylosing spondylitis
WANG Li, LIU Hong, XIA Wei-min.
The Department of Laboratory, ZiBo Central Hospital, Zibo 255036，China
【Abstract】Objective The flow cytometer assay was used to investigate the express levels of HIA-B27 in patients with ankylosing spondylitis (AS) and according to the clinical diagnosis to discuss the clinical signification of the setting of clinical value to the diagnosis of AS. Methods Flow cytometer from American BD company was used to test the express levels of HLA-B27 from 95 patients with AS, 226 non-AS patients, and 50 healthy control. Results According to the critical value of BD (≥147)，there were only 58 positive cases (61.05％) in AS group and there were 17 AS patients whose HLA-B27 levels were between 140 and 146, there were 11 positive case (4.87%) in non-AS group, and there were 3 positive cases (6.00％) in healthy group. Conclusion The positive rate in AS group is too low, which didn't correspond with the clinical diagnosis. The critical value of importing reagent box is so high that a large amount of padents were let off. If we lower the critical value, the positive rate of HLA-B27 with flow cytometer could be raised and flow cytometer can be more useful to the clinical diagnosis and differential diagnosis.
【Key words】HIA-B27; flow cytometer assay; ankylosing spondylitis; critical value
强直性脊柱炎(ankylosingspondyli,AS)是以中轴关节慢性炎症为主的全身性自身免疫性疾病，主要累及骶髂关节、髋关节、椎间关节、肋间关节，而以骶髂关节病变最多见，常可致畸。AS诊断主要建立在影像学检查的基础上，缺乏实验室特异性诊断指标，给早期诊断带来困难。HLA-B27是人类白细胞抗原B位点上的一个重要等位基因。早在20多年前，人们就已发现HLA-B27抗原的表达与强直性脊柱炎密切相关［1，2］。AS患者HLA-B27的阳性率达90%以上，而正常人群HLA-B27的阳性率仅为3%～12%。因此HLA-B27的检测已成为临床诊断和鉴别诊断AS的重要辅助手段。近年来，流式细胞仪以其强大精确的细胞分析能力，被认为是当前分析HLA-B27最好的方法之一［3］，在临床上的应用日益广泛。由于不同种族人群中HLA-B27的阳性率不同，进口试剂盒使用的判断阴阳性的临界值可能并不适用于亚洲人。因此有必要调查分析适用于本地的临界值。笔者使用美国BD公司的流式细胞仪与试剂盒检测HLA-B27，以其临界值判断阴、阳性，发现其阳性率偏低，有可能漏诊一部分患者。因此笔者结合临床诊断，探讨分析临界值设置对AS诊断的影响，以寻求更适合的参考临界值。
1 材料与方法
1.1 检测对象
2007年5月—2009年7月我院门诊及住院AS患者95例，其中男74例，女21例，年龄14～58岁，均符合AS诊断标准（采用1984年纽约修订AS诊断标准）。非AS患者226例（包括腰腿背痛患者87例，其他SPA患者62例，类风湿性关节炎43例，风湿性关节炎34例），健康对照组50例。
1.2 仪器与试剂
FACSCalibur流式细胞仪为美国B-D公司产，荧光标记抗体Anti-HLA-B27-FITC/CD3-PE,10*溶血剂，FL1Calibration beads 均为美国B-D公司产品。
1.3 检测方法
1.3.1 标本处理
取肝素抗凝全血50μl 和Anti-HLA-B27-FITC/CD3-PE30ul于流式检测管中，充分混匀，室温下避光反应20min，加1*溶血剂2ml混匀，室温下避光反应10min，(1500r/min)离心5min，弃上清，加PBS洗涤（1500r/min）离心5min弃上清，加1%多聚甲醛（PFA）200μl固定待测。
1.3.2 检测
打开HLA-B27自动分析软件，用Calibration beads 调试仪器，成功后上样。在FSC-FL2 的点图上确定CD3强阳性细胞群体的位置，并设定一个CD3+淋巴细胞门，后根据FSC设定光散射门，除去FSC过大或过小的细胞,自动计数15000个细胞，随后计算FSC/FL2 门内细胞抗HLA-B27-FITC信号的平均荧光强度（FMI），并与desition marker的值相比较，大于或等于为阳性，小于为阴性。
2 结果
2.1 95例AS患者和226例非AS患者HLA-B27抗原检测结果
见表1。表1 95例AS患者和226例非AS患者HLA-B27抗原检测结果（略）
利用FCM检测95例AS患者HLA-B27，以B-D公司设定的界值≥147为准，AS组HLA-B27的阳性率仅为61.05%, 远远低于文献报道，39.0%的AS患者HLA-B27检测结果为阴性,这样有可能造成一部分患者漏诊。17.89%的患者，其HLA-B27检测平均荧光强度值在140～146之间，这一部分检测结果接近界值，所占比例也较高。非AS组中HLA-B27抗原阳性率为4.87%，有5.31%的非AS患者其HLA-B27抗原检测结果在140～146道数之间。健康对照组阳性率为6 %（3/50）。
2.2 采用B-D公司流式细胞仪检测结果与临床诊断符合情况
见表2。表2 采用B-D公司流式细胞仪检测结果与临床诊断符合情况（略）
3 讨论
强直性脊柱炎是一种严重危害人体健康的全身性疾病。流行病学资料显示，本病的发病高峰年龄为20～30岁，40岁以后发病少见，男性比女性多见。过去认为AS是一种较少见的脊柱疾病，随着风湿病学在我国的起步和发展，认识到本病在国内并不少见。由于本病起病缓慢而隐匿，首发症状多为十分常见的临床症状，如腰痛或外周关节痛，临床上容易误诊。目前临床AS诊断通常采用纽约标准或1984年纽约修订分类标准，但二者对影像学检查依赖较大，要求有肯定的骶髂关节炎，临床实践证明二者标准皆过于严格，满足其条件者病情均非早期。自1973年发现HLA-B27和强直性脊柱炎具强相关性以来，其在AS诊断中的作用日益受到重视，但对于HLA-B27在AS临床诊断中所占权重一直有所争议［4］。另外，虽然流式细胞仪在检测HLA-B27中得到越来越广泛的应用，但其阳性临界值多参考国外标准，中国人群有关参考值少见报道。因此，寻求HLA-B27的参考值及其在AS中的诊断价值显得十分重要。笔者的研究结果显示：AS患者最小发病年龄为14岁，高峰发病年龄为18～37岁（占80%），男女比例是3.52：1，男性明显多于女性，与以往报道一致［5］。在非AS组，包括腰腿背痛，风湿、类风湿性关节炎和其他SPA患者，HLA-B27均有一定的阳性率，符合文献报道，说明HLA-B27阳性并非一定是AS，而HLA-B27阴性也不能完全排除AS。分析本次研究数据可以发现，以美国B-D公司试剂盒给出的临界值≥147作为判断阳性的标准，AS患者的HLA-B27阳性率为61.05%，有38.95%的AS患者HLA-B27检测结果为阴性，这部分患者很可能被漏诊。同时，有17.89%的患者检测HLA-B27荧光强度道数在140～146之间，非常接近临界值。如果以≥140为临界值，则其阳性率提高到79%。表2比较了应用不同临界值时的诊断效能，在应用原临界值≥147时，灵敏度为0.61，特异度为0.95，当把临界值调整为≥140时，其灵敏度提高到0.79，而特异度降低也不多。若将临界值调整为≥130，其灵敏度升幅不大，仅为0.82，但其特异性下降明显，诊断效能明显降低。由于早期诊断AS有助于早期干预治疗并改善其预后，所以，尽管调整临界值为≥140后，损失了一部分特异性，但有助于AS患者的早期诊断，有更大的临床意义。同时，调整临界值后，非AS组HLA-B27阳性率未见明显提高，仅为10.18%，与多数报道相符。由于流式细胞术检测HLA-B27抗原的荧光强度与样本T细胞表面HLA-B27抗原表达量有关，同时存在人种差别和个体差别，进口试剂盒是以白种人为样本设定的临界值，是否适合中国人群有待考证，笔者认为它的临界值设定偏高，可能会使一部分AS患者漏诊，将其临界值调整为≥140道数更为符合本地区情况，但仍需进一步加大样本量验证并寻求更精确的界值。
【参考文献】
1 Mcmichel A，Bell J．HLA一27：a diease-associated immune re-sponse gene．Res Immunol，1991，142(5-6)：475-482．
2 Liu Y，Li J，Chen B，et al．Familial aggregation ankylnsing spondylitis in Southern China．Rheumatol，2001，28(3)：550-554．
3 Levering W H，wind H，sintnicolaas K，et al. Flow cytometric HLA-B27 screening： cross-reactivity pattems of commercially available anti-HIA-B27 monoclonal antibodies with other HLA-B antigens．Cytometry，2003，54：28-38．
4 Sweeney S，Gupta R，Taylor G，et a1．Tatal hip Ahmplasty in ankylosing Spotdylitis：outcome in 340 patients．J R heumtd，2001，28(8)：1862.
5 倪吴花,胡晓霞，章圣辉,等．强直性脊柱炎867例HLA-27的表达及意义．实用医学杂志，2008，24(9)：1511．
作者单位：255036 山东淄博,淄博市中心医院检验科