点击显示 收起
摘 要：［目的］研究神经长度是否影响化学去细胞神经的质量及化学去细胞异体神经修复犬神经缺损的适当长度范围。［方法］切取犬的坐骨神经全长，截取直径近似段长度12 cm，去除神经外膜的脂肪组织及血管，在50％Triton X100和50％脱氧胆酸钠中重复消化得到化学去细胞神经；部分神经用于组织学评价，将12 cm神经按顺序切割为6段，石蜡包埋制备切片，厚度5 μm。HE染色和Fastblue染色，观察去细胞程度、神经细胞外基质结构完整性、髓鞘染色强度，观察每段神经的差异。在体内实验中，用化学去细胞异体神经桥接犬的坐骨神经缺损，缺损长度分别为8、10 cm组，每组各有6条成年犬，随访时间12个月。观察动物肢体功能恢复、肌电图变化及再生神经组织学表现，包括HE染色、S100免疫组织化学染色、乙酰胆碱酯酶染色。［结果］去细胞神经全长各段在去细胞程度、结构完整性及残余髓鞘染色综合评价中无差异。体内移植实验结果显示8 cm去细胞异体神经移植组的犬在术后12个月踝关节可直立行走，而10 cm去细胞异体神经移植组犬12个月时踝关节不能直立行走。肌电图检查结果显示，两组动物的手术肢体均可记录到诱发的运动和感觉电位。肌电图波幅、时限及运动神经传导速度结果显示，8 cm移植组明显高于10 cm移植组(P<005)。组织学检查显示8 cm移植组再生的神经轴突通过移植段神经到达远侧的神经中，并与所支配的肌肉建立新的运动终板联系，坐骨神经支配的小腿三头肌中有大量新生的运动终板形成。在10 cm移植组有部分再生的神经纤维通过移植段神经进入远端的神经，小腿三头肌中新生的运动终板数量和大小明显低于8 cm移植组(P<005)。［结论］在化学去细胞神经的制备中，神经的长度对去细胞的质量无影响；化学去细胞异体神经修复神经缺损的长度若不超过8 cm可取得较满意的功能康复结果。
关键词：去细胞神经； 异体移植； 再生
Experimental study of repairable length of nerve defects with acellular nerve allografts∥SUN Mingxue, LU Shibi, TANG Jinshu, et al. Institute of Orthopedics, PLA General Hospital of Chinese, Beijing, 100853
Abstract：［Objective］The purpose of this paper is to demonstrate whether the nerve length could affect the quality of acellular nerve and investigate the properly repairable distance of nerve defects with acellular nerve allografts. ［Method］Fresh sciatic nerves were obtained from adult dogs and divided into 12 cm long segments. The nerve segments were decellularized via an improved chemical decelluarization treatment as following: Nerve segments were rinsed with cold sterile Ringer's solution and submergedin 5% Triton100 solution 12h ,and then soaked the nerve segments into 5% sodium deoxycholate for 12h. The treated nerve segments were washed in distilled water for 3h. This procedures were repeated once again. In vitro, the degrees of decellularization , demyelination and integrity of nerve fiber tubal of chemically extracted acellular nerves were observed with microscope and assessed by a score system. In vivo,the sciatic nerve of dogs on the right was exposed.In 8 cm grafted group (n=6),a 7 cm segment of sciatic nerve was removed from the midthigh level. In 10 cm grafted group (n=6) , a 9 cm segment of sciatic nerve was removed at the same level. The gaps were bridged with acellular nerve allografts by 8 cm and 10 cm long segments respectively. The followup period was 12 month postoperatively. Motor functional recovery of the right hind following allografting was examined by neurobehavioral, electrophysiological, histological and immunohistochemical assessment. ［Result］There was no difference on the degrees of decellularization, demyelination and integrity of nerve fiber tubal among every fraction of the acellular nerve from the two ends to the central portion. In 8 cm grafted group , all survival dogs(n=5) were held upright with the affected hindlimb extended so that the body's weight was supported by the distal metatarsus and toes. In 10 cm grafted group, animals were failed to held upright with the affected hindlimb. Electrophysiological studies showed that elctromyographic activity was observed in both groups.After 12 month the conduction velocity was 321+51 m/s in 8 cm grafted animals and 183+6.0m/s in 10 cm grafted group. In normal animals, the conduction velocity was 1066+164 m/s. The conduction velocity in 10 cm grafted group was lower than 8 cm grafted(P<0.05) and normal nerve(Ｐ<001) significantly. Histological examination showed that axons sprouted from the proximal portion and reached the distal stump across the gap, but the myelinated axons was lower in 10 cm grafted animals than in 8 cm grafted. S100 staining indicated that Schwann cells presented in the central portion of both graft groups. In 8 cm grafted group, a great deal of Schwann cells arranged along the longitudinal directions. Motor endplates at the nervemuscle junction were observed in both grafted groups with acetylcholinesterase staining. The number and size of endplate in 10 cm grafted group was lower than 8 cm grafted(P<0.05) and normal nerve(Ｐ<0.01) significantly. ［Conclusion］In the procedure of chemically extracted acellular nerve, the length of treated nerve does not affect the quality of acellular nerve. Eightcm gap may be the properly repairable extent of nerve defects with acellular nerve allografis.
Key words: Acellular nerve; Allograft; Regeneration
创伤、理化因素及肿瘤等原因可导致周围神经的损伤，造成长距离的神经缺损。为恢复肢体的神经支配通常需要应用移植物桥接神经缺损。该类移植物的功能是引导神经纤维通过缺损区并长入支配的器官和组织。由于新鲜异体神经移植的免疫学反应，在临床实践中自体神经移植一直被认为是“金标准手术”。但是由于切取自体神经带来的诸多并发症及供区所限，自体神经替代物修复神经缺损成为研究的重点。人工合成的替代物主要是由具有良好生物相容性和生物可降解材料制备，如PLA(polylacticacid)［1,2］，PLGA［poly(lacticcoglycolic)］［3］等。合成材料虽然可避免切取自体神经的并发症及异体神经的免疫反应，但在内部结构上不具备天然神经细胞外基质的三维空间结构，而这种结构对引导神经轴突的生长至关重要。异体神经的MHC(major histocompatibility complex)主要存在于神经的雪旺细胞和髓鞘成份中，近期研究显示经化学处理的去细胞异体神经可有效降低移植后的免疫反应并促进神经轴突向远端生长［4,5］，从而修复周围神经的节段性缺损。因此，化学去细胞异体神经已成为一种具有应用前景的自体神经替代物，并对其神经移植物的保存方法进行了研究［6］。然而，在实验研究中，对下述两个问题尚未进行深入研究：(1)较长节段神经的化学去细胞处理是否会造成神经断端与神经中段质量的差异；(2)在大型动物神经缺损修复中有效的长度范围为多少。上述问题的研究对制备较长的去细胞神经移植物和选择修复神经缺损的长度具有重要意义。
1 材料与方法
11 仪器及试剂
Medtronic Keypoint肌电图仪(丹麦)，恒温振荡器(回旋式，上海)，Triton X100(Sigma，美国)，脱氧胆酸钠(Sigma，美国) 。
12 犬化学去细胞神经的制备
已行钴—铬—钼人工假体体内植入实验并准备取材的实验犬6条，体重在24～26 kg，用速眠新100 mg肌注后全麻安乐死，取双侧全长的坐骨神经干，每条坐骨神经长约12 cm。将切取的全长犬坐骨神经标记远近端后，按下述顺序进行化学处理：(1)蒸馏水浸浴12 h；(2)50％Triton X100消化12 h;(3)蒸馏水浸浴3h；(4)50％脱氧胆酸钠消化12 h；(5)重复前述步骤；(6)蒸馏水浸浴3 h；(7)萃取神经在4℃、 pH 72无菌磷酸盐缓冲液(PBS)暂时保存；(8)将处理好的去细胞神经组织和Hank’s液一起用双层无毒塑料袋进行分装，在250 KGy的γ射线下进行辐照灭菌，放置在4℃冰箱中备用。
13 去细胞神经的组织学评价
去细胞处理后的神经组织，将每一神经段按等比例分为6小段，每小段长为20 mm，石蜡包埋，做5 μm厚横向和纵向组织学切片，进行HE染色观察去细胞程度及纤维管道结构完整性、Fast blue染色观察髓鞘成分。按照表1的标准进行去细胞神经的质量评价。每段随机取3张切片进行观察，取其均值单项计分。
14 去细胞异体神经移植试验
健康杂种犬12只，雌雄不分，体重243～266 kg，随机分成2组，8 cm移植组和10 cm移植组，每组 6只。用25％戊巴比妥钠(10 mg／kg体重)静脉注射进行麻醉。在无菌条件下右股后切口显露坐骨神经干。在坐骨神经干中段分别锐性切除7、9 cm长的神经节段，自然回缩造成8、10 cm长的神经缺损。分别用8、10 cm长的化学去细胞同种异体神经进行移植桥接神经缺损，用8-0无创尼龙线行神经外膜缝合，环形缝合6针。术后分笼饲养，观察期12个月。
15 体内移植实验观察
151 一般观察 观察移植后切口愈合及肢体功能恢复。
152 神经电生理观察 用丹麦产Medtronic Keypoint便携式肌电图仪进行运动和感觉诱发电位的检测。随机选取左侧非手术侧肢体5例作为正常值对照。在全麻下手术切开显露待测神经。
在进行运动诱发电位检查时，将刺激电极放置在移植段神经近侧2 cm的正常神经上，记录电极放置在小腿三头肌上，通过给予相同剂量的方波刺激比较两组实验动物在运动诱发电位波幅和时限上的区别。左侧肢体电极放置在相应位置，刺激参数为：10～20 mA，01 ms，10 Hz。
在进行感觉诱发电位观察时，刺激电极放置在踝关节部的胫神经上，记录电极放置在移植段近侧的正常神经上。刺激参数为50～100 mA，02 ms，19 Hz。
运动神经传导速度检查时，在移植侧，近端刺激电极位于移植段近端吻合口近侧2 cm处，远端记录电极位于移植段远端吻合口远侧2 cm处，两实验组距离分别为12、14 cm。在对照侧，两点位于与右侧相应部位的坐骨神经干上，间距10 cm。刺激参数为10～20 mA，02 ms，10 Hz，肌电图仪自动记录并计算运动传导速度。
153 再生神经的组织学观察 在过量麻醉药物的作用下处死实验犬并即刻观察取材。对实验组全部动物的移植段神经的近侧吻接口、移植段中央、远侧吻接口、移植段远侧神经和神经支配区域的靶肌肉进行神经再生的组织学观察。
1531 HE染色 将切取的移植神经及两端各1 cm正常神经取出后浸于4％多聚甲醛水溶液中固定24 h，经脱水处理后分段用石蜡进行包埋，连续组织学切片，切片厚度为5 μm，苏木素-伊红染色后观察组织结构形态，再生神经纤维和细胞浸润情况。
1532 S-100免疫组化染色 标本为石蜡包埋，切片厚度5 μm。Ⅰ抗为兔抗S-100蛋白抗体，Ⅱ抗为生物素标记的羊抗兔IgG抗体。用于观察再生神经中的许旺细胞的分布情况，特别是移植段神经中许旺细胞的分布。
1533 美蓝复红染色 在移植段中央和移植段远侧的神经中各取2 mm×１ mm×１ mm大小的组织块用05％戊二醛固定24 h，树脂包埋后用于半薄切片美蓝复红染色，切片厚度2 μm，染色后观察有髓神经纤维。
1534 透射电镜观察 将经05％戊二醛固定后树脂包埋的神经组织行超薄切片，醋酸铀和枸橼酸铅双重染色。在SEM透射电镜下观察再生神经的超微结构。
1535 靶肌肉运动终板染色 在胫神经进入小腿三头肌肌腹部位切取3 mm厚的肌肉块，在含1％氯化钙的 10％福尔马林水溶液中固定24 h，取出后放置在蔗糖-凝胶溶液中，行冰冻切片，切片厚度为30 μm。用胆碱酯酶法进行运动终板染色，观察靶肌肉中再生的运动终板的形态。每张切片随意选3个视野计数运动终板数量，取其平均数。
16 统计学分析
用SPSS 115统计分析软件进行数据处理，组间对比用成对资料的t检验，P<005差异有显著性。
2 结 果
21 去细胞神经各段间组织学观察结果
神经全长从近端到远端去细胞完全，评分均为0分；在结构观察中，除第2段为0分外，其余5段均为1分，存在轻度的结构破坏：观察髓鞘染色强度，神经全长均为1分，仍残留少部分髓鞘成分。综合评分第1段为2分，第2段1分，第3段到第6段均为2分，神经全长各段经去细胞处理后综合评分相似（见表1）。 表1 化学去细胞神经评分标准
22 移植动物一般情况和功能观察
8 cm组有1犬在移植后3个月并发肺部感染死亡。10 cm组有1犬在4个半月腹泻死亡。其余动物均存活至观察期满。 在8 cm组实验犬在移植术后3个月时均有不同程度运动功能的恢复，至6个月时恢复了较好的行走功能，但是外观上仍有轻微的跛行，12个月时在行走过程中踝关节可以完全直立和有较好的背屈。10 cm组在6个月时也有不同程度的下肢功能恢复，但是进展较慢，移植后12个月踝关节仍不能直立或爪背着地。
23 神经电生理观察
在移植段近侧的正常神经上给予电刺激时，8 cm组和10 cm组均在小腿三头肌上记录到诱发的运动神经传导电位。如表2所示移植术后12个月记录到的运动诱发电位时限和波幅的区别，8 cm组的波幅高于10 cm组(t=3286，P<０05)，时限也长于10 cm组(t=1002，P<０01)。运动神经传导速度8 cm组快于10 cm组(t=3659，P<０05)。8 cm组的传导速度在12个月时已达到正常神经的30％，而10 cm组只有正常神经的17％。8 cm组在进行感觉诱发电位检查时有4犬检测到宽大的W波，而在10 cm只有1犬可以检测到宽大的W波，而且波幅较低。
24 再生神经组织学观察
大体上观察，8 cm组在局部切开检查时，移植段神经与周围组织有轻微的短缩，可见移植段神经有良好的连续性，无明显变细变硬。神经与周围组织有少量的粘连，再血管化良好。近侧和远侧吻接口无神经瘤形成。神经支配区的肌肉组织有轻度萎缩。10 cm组在切开检查时，可见移植段神经的远侧段明显变细变硬，但是仍然保持连续性，神经与周围组织有粘连，神经支配区肌肉萎缩明显。 表2 去细胞异体神经移植术后12个月肌电图结果光镜下，在两组移植段神经内均有S-100表达阳性的雪旺细胞，沿神经纤维方向呈带状排列(图1)，8 cm组的数量多于10 cm组。移植段以远的神经内亦可见到雪旺细胞增殖成带，神经横切面显示有再生的神经纤维，8 cm组优于10 cm组，在10 cm组可见较多神经束呈脱髓鞘改变。
运动终板染色显示在神经支配区的小腿三头肌中可以见到重新形成的运动终板结构，两组实验犬在运动终板数量上有较明显的差别，8 cm组再生的运动终板数量多于10 cm组，终板的形态也优于10 cm组(图2)。每个高倍视野下的运动终板的数量在8 cm组明显多于10 cm组，有显著统计学差异(P<０05)。终板的纵横径8 cm组>10 cm组。但是两组终板和正常的终板结构相比不管是在终板的数量还是在终板的纵横径上均有差别(P<001)(表3)，正常终板结构近似圆形，而重建的终板呈椭圆形。
电镜下8 cm组移植段神经内可见由雪旺细胞形成的髓鞘和有髓神经纤维，同时可见大量的无髓神经纤维呈束状分布(图3)；10 cm组移植段神经内也有少量有髓神经纤维形成。表3 去细胞异体神经移植术后小腿三头肌运动终板测量
3 讨 论
在异体神经移植的研究中，虽然经冻融处理、放射处理和化学处理后的异体神经均具有促进神经再生的功能，但由于冻融处理及放射处理的神经细胞碎片仍残存在神经的基底板层管内，妨碍神经轴突向远端的延伸，因此修复神经缺损的距离一般较短。而化学处理后的异体神经在降低免疫原性的同时，保留了神经纤维管道的结构完整性，其内部细胞碎片已被清除，去除了轴突生长的障碍，因此可用于修复较长距离的神经缺损。但在化学去细胞处理过程中，当为修复较长距离的神经缺损而处理较长神经段时，神经的两端与中央部位是否存在质量差异，对修复神经缺损有较大的影响。化学浸提液是从神经的两端还是透过神经外膜对神经进行去细胞处理存在争议。实验中从去细胞程度、髓鞘提取的程度及神经纤维管道的完整程度进行评价。结果显示在长12 cm的神经段中，经化学去细胞处理后，神经的中央部分与两端的各段间在上述三个方面的综合评价中无差异，说明对同等粗细的神经其长度并不影响其神经移植物的质量，由此可以推断化学浸提液并非从神经的两端而是从神经的外膜开始进行去细胞处理。故在用相同的浸提液及处理程序进行去细胞处理时，神经的长度对神经移植物质量无影响。
虽然在理论上可以应用化学去细胞的方法处理任意长度的神经，但在实验及临床应用中移植长度仍然影响肢体功能康复的结果。在早期的研究中应用化学去细胞异体神经较满意修复了犬5 cm长的坐骨神经缺损［7］。在应用相同方法处理的犬的化学去细胞异体神经移植实验中，对犬的8、10 cm 长的坐骨神经缺损用化学去细胞同种异体神经进行移植修复。结果发现在8 cm长的坐骨神经缺损修复组，无论是肢体功能的大体观察还是电生理的观察，均恢复较好。运动神经的波幅已达正常神经的50％，神经传导速度达到正常神经的30％；而在10 cm长的神经移植组，功能恢复较差，肌电图波幅及运动神经传导速度均未达到正常神经的20％。再生神经的组织学观察显示8 cm长的去细胞神经移植组在雪旺细胞、有髓神经纤维的分布及运动终板的数量和形态方面均明显优于10 cm移植组。
在8、10 cm神经移植组，其移植物本身的质量无差异，但最终结果具有明显的差异。产生这种差异的原因不在移植物本身，而与神经缺损的距离有关。Haase等［８］用去细胞异体神经桥接大鼠腓神经缺损，研究显示去细胞异体神经可以修复2 cm的周围神经缺损，当缺损>4 cm时未出现功能恢复，并认为生长因子可能有助于修复较长的神经缺损。但在随后的实验中应用血管内皮生长因子与去细胞异体神经复合后移植修复神经缺损，仅表现出促进近端吻合口轴突的生长，并未显出促使神经轴突延长的作用［9］。出现这种现象的原因可能是生长因子虽有促神经再生的作用，但在修复区内未能呈现生理环境下的浓度梯度变化，故轴突的生长方向受到干扰。在周围神经损伤后，靶器官通过神经远端释放不同的生物因子，发挥化学趋化作用，促使神经轴突向远端生长。生物因子的浓度呈现明显的梯度改变趋势，随距离的增加，生物因子的浓度发生明显的变化，从而影响神经的再生速度及肢体功能康复。因此，在使用生长因子促使神经向远端生长时应考虑其作用环节及浓度梯度变化。
本研究证实神经的长度并不影响化学去细胞神经制备的质量，在应用去细胞异体神经修复周围神经缺损中，8 cm或许是目前单独使用化学去细胞异体神经移植取得较好结果的最大范围。为修复更大范围的神经缺损，应探讨神经远端的生物因子表达分布规律，利用化学趋化原理促进神经的快速生长。
参考文献：
［1］ Hadlock T，Elisseeff J，Langer R，et al．A tissueengineered conduit for peripheral nerve repair［J］．Arch Otolaryngol Head Neck Surg,1998,124：1081-1086．
［2］ Evans GR，Brandt K，Widmer MS,et al．In vivo evaluation of poly(Llactic acid)porous conduits for peripheral nerve regeneration［J］．Biomaterials，1999,20：1109-1105．
［3］ Widmer MS，Gupta PK，Lu L，et al．Manufacture of porous biodegradable polymer conduits by anextrusion process for guided tissue regeneration［J］．Biomaterials，1998,19：1945-1955．
［4］ Hudson TW，Zawko S，Deister C，et al．Optimized acellular nerve graft is immunologically tolerated and supports regeneration［J］．Tissue Eng,2004,10(11，12)：1641-1651.
［5］ Kim BS，Yoo JJ，Atala A．Peripheral nerve regeneration using acellular nerve grafts［J］．J Biomed Mater Res A，2004,1；68(2)：201-209．
［6］ 衷鸿宾，卢世璧，赵庆，等．化学去细胞神经同种异体移植物储存方法的初步研究［J］．中国矫形外科杂志，2002，10：1405-1407．
［7］ 衷鸿宾，卢世璧，赵庆，等．犬化学去细胞神经同种异体移植的神经再生研究［J］．中华手外科杂志，2002，18：131-133．
［8］ Haase SC，Rovak JM，Dennis RG，et al．Recovery of muscle contractile function following nerve gap repair with chemically acellularized peripheral nerve grafts［J］．J Reconstr Microsurg，2003，19(4)：241-248．
［9］ Rovak JM，Mungara AK，Aydin MA，et al．Effects of vascular endothelial growth factou on nerve regeneration in acellular nerve grafts［J］．J Reconstr Microsurg，2004,20(1)：53-58.
(中国人民解放军总医院全军骨科研究所， 北京 100853)