激素性骨坏死关节软骨下皮质骨病理改变的实验研究

　　摘  要：

　　［目的］观察激素性骨坏死关节塌陷早期软骨下皮质骨的病理形态改变，分析关节塌陷的原因。［方法］将新西兰白兔分为两组，A组复制激素增强的Shwanzman反应骨坏死模型，B组为空白对照组。停药后10周获取肱骨头标本，分别制备脱钙和不脱钙切片，脱钙标本HE染色，观察软骨下皮质骨改变，哈佛管计数。不脱钙标本进行荧光观察，比较软骨下皮质骨形态、结构；扫描电镜观察，比较软骨下微循环改变、软骨下方骨组织形态、结构改变。［结果］A组标本出现坏死改变。软骨下方骨组织内哈佛管减少消失，即软骨下皮质骨及由其构成的球拱、桥拱结构破坏，支撑软骨层的骨组织呈松质骨改变。有部分肱骨头出现关节塌陷早期改变。软骨下微血管内广泛存在红细胞淤滞、填塞现象。B组软骨下方骨组织具有较丰富的哈佛管，为皮质骨。完整且连续的皮质骨支撑关节软骨，同时构成球拱、桥拱结构。软骨下微血管内无红细胞淤滞、填塞现象。［结论］关节软骨下皮质骨缺失是关节发生塌陷的原因。软骨下微循环障碍是其重要原因。

　　关键词：激素性骨坏死；  软骨下皮质骨；  关节塌陷；  兔

　　中图分类号  R681      

　　Experimental investigation of the pathological changes in subchondral cocortical bone in steroidinduced osteonecrosis

　　ZHANG Dezhi,HU Yunyu,FEI Zhengqi,et al.

　　Institute of Orthopedics, Xijing Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032

　　Abstract：［Objective］To investigate the morphological changes that take place in the subchondral cocortical bone in steroidinduced osteonecrosis and analyze the reasons leading to humeral head collapse in juvenile rabbits. ［Method］Fivesix monthold female rabbits were separated by two groups. A modified version of the methods was used to replicate steroid enhanced osteonecrosis anminal humeral head models with Shwartzman reaction in group A,and group B served as the single control. Each humeral head was obtained 10 weeks after the drugs injection. Subchondral cortical bone was observed,and the number of haversian canals was counted. The microcirculatory changes were also detected with scanning electron microscope. ［Result］In group A, the Haversian canals in' subchondral area almost disappeared;the subchondral cortical bone disappeared with its arch,dome and bridge structures. Microcirculatory stasis happened in the subchondral vessels. Some humeral heads collapse were observed. While in group B, subchondral cortical bone is integrity and continuity, forming arch,dome and brige structures with subtrabecular bone. ［Conclusion］The disappearance of the subchondral cortical bone is a major reason leading humeral head collapse,and ischemia is the critical reason of it.

　　Key words: Steroid induced osteonecrosis;  Subchondral cortical bone；  Collapse；  Rabbits

　　激素应用是非创伤性骨坏死的常见诱因之一。随着激素使用量的逐年增加，激素的副作用日益受到重视。激素性骨坏死尚缺乏有效的预防和治疗方法。关节塌陷是影响骨坏死预后的重要原因［1］，作为力学要素，软骨下皮质骨是重要的支撑结构。软骨下部骨组织损害在整个发病机制中是不可缺少的因素［2］。因为临床上很难获得骨坏死关节塌陷前期、早期临床病理资料。本实验对肱骨头塌陷前期、早期软骨下皮质骨的病理形态改变进行了初步观察，分析关节塌陷的原因，为临床诊断治疗提供参考。

　　1  材料与方法

　　11  实验动物及分组

　　新西兰白兔，5～6个月龄，雌性。体重2～3 kg，适应1周后开始实验。分两组：A组：16只，复制激素增强Shwartzman反应模型［3］，给予脂多糖和地塞米松；B组：6只，为空白对照组，给予生理盐水。

　　12  试剂与准备

　　脂多糖(LPS)  购自Sigma公司，大肠埃希杆菌来源、血清型0111：B4。LPS粉剂称重，分装，保存于2～8 ℃下。滤器内放置浸泡过的双层02 μm微孔滤膜，灭菌备用。

　　复溶、滤过除菌：实验前在超净台内将LPS复溶于生理盐水中，浓度为100 μg／ml，即将LPS先溶于1／3量生理盐水，振荡20～30 min；滤器内先注入生理盐水2 ml，再将LPS加压注入滤器；在振荡状态下，将剩余生理盐水等分，分2次洗涤LPS容器和滤器;最后向滤器内加压注入空气，减少滤器内液体残留。更换注射器分装，置于4 ℃冰箱内保存。实验时需振荡20～30 min后使用。用药间隔时间保持全程振荡状态。

　　13  动物建模

　　A组实验第1、2 d间隔24 h于耳缘静脉缓慢注射LPS，剂量05 ml／kg；第3～8 d，耳缘静脉注射地塞米松，每日1次，剂量75 mg／kg。B组给予生理盐水(05 ml／kg)。动物在无麻醉的清醒状态下给药。不给予抗菌素。相同条件下喂养。满10周取材。取材前48 h饲料中添加土霉素(250 mg／kg)。

　　14  观察指标

　　141  一般观察  动物穿刺点情况，精神状态、进食状况观察。

　　142  大体观察  观察肱骨头表面以及冠状面颜色以及顶部滑车是否光滑。

　　143  骨组织学、形态计量学观察  沿冠状面将肱骨头自中线切开分为2份。1份标本10％中性甲醛固定，脱钙，脱水，石蜡包埋，切片，厚度4 μm，HE染色，观察软骨下方骨组织改变：依照Clark JM［4］给出的参数和特征确定哈佛管；在软骨下部位，沿潮线方向进行哈佛管计数，计算单位长度(mm)内哈佛管数量(个／mm)。另1份标本80％酒精固定，不脱钙，脱水后塑料包埋，切片，厚度30 μm，在荧光下观察骨结构的连续性，骨髓腔和软骨下方骨组织形态、结构。

　　144  微循环观察  不脱钙切片经过脱塑，临界点干燥，喷金，扫描电镜下观察软骨下微血管内红细胞淤滞、填塞现象。

　　145  统计学处理  所测数据以±s表示，用SPSS统计软件进行两样本均数比较的t检验。

　　2  结  果

　　21  一般观察

　　两组动物穿刺点均迅速愈合，无渗出、化脓。A组16动物中存活4只。实验第1周精神萎靡，进食状况差，1周后精神状态逐渐好转，进食量增加。

　　22  大体观察

　　表面观察：A组标本表面颜色不均匀，见形态不规则的白色区域(图1)；部分标本滑车加深，欠光滑。B组标本表面颜色呈均匀的淡红色，未发现白色区域(图2)；滑车较浅。冠状切面观察：A组标本切面内见大小不等的白色区域，界限清楚者被红色充血带包围；部分标本外侧顶部不平坦。B组标本切面未见白色区域，呈均匀的浅红色。

　　23  骨的组织学观察

　　231  脱钙切片观察 

　　骨坏死改变观察：A组标本出现骨坏死改变，小梁骨骨细胞核固缩、空骨陷窝很多；与软骨邻接的骨组织菲薄、凹凸不平，哈佛管几乎消失，只能偶然观察到孤立的夹杂在小梁骨中间的哈佛管：软骨直接与髓腔相通；钙化层变薄甚至消失(图3)。B组未观察到骨细胞核固缩以及空骨陷窝形成；软骨下方骨组织厚而平坦致密，有丰富的哈佛管，为软骨下皮质骨(图4)。

　　关节塌陷观察：A组部分标本滑车负重部位关节面出现塌陷改变，塌陷部位表现为关节面及下方骨质凹陷，软骨出现裂隙(图5）。

　　232  不脱钙切片荧光观察 

　　A组标本软骨下方骨质呈多孔状，哈佛管几乎消失，呈松质骨改变(图6)。软骨邻近部位髓腔失去圆拱、球拱形态而变扁变平；甚至在软骨下方见到骨小梁断裂现象。B组标本软骨下方骨组织厚而致密，哈佛管丰富，为皮质骨(图7)。小梁骨呈拱墩状支撑密质骨构成桥拱、球拱形态(图8)。

　　233  骨形态计量学观察 

　　A组软骨下哈佛管计数：088±113个／mm，B组软骨下哈佛管计数：1050±217个／mm。A、B两组软骨下哈佛管计数差异存在显著性意义(t=11324，P<00001)。两组软骨下哈佛管计数比较见表1。

　　表1  A、B两组软骨下哈佛管计数比较（略）

　　注：两组比较t=11.324,P<0.0001。

　　24  微循环观察

　　扫描电镜发现：A组标本软骨下骨组织吸收变成多孔状，血窦侵入，形成管径不一致、周壁不规则、不光滑的较大腔道(多>40 μm)，血管通道内见红细胞淤滞、填塞。B组软骨下骨皮质骨则分布微小管道(多<40 μm)，其管径大小一致、周壁圆滑；小梁骨呈拱墩状支撑密质骨构成桥拱状结构。血管通道内未见红细胞淤滞、填塞现象。

　　3  讨  论

　　激素增强Shwartzman反应模型是研究激素性骨坏死较常用的动物模型。由于雌性动物经LPS刺激后反映更为敏感［5］，未成年动物较成年者更易遭受血管介导的损伤［6］，本实验采用未成年雌性新西兰白兔为研究对象使动物模型复制更易成功，骨损害更加严重。兔肩关节负重应力更集中作用于肩峰—肱骨头接触  部位，因此，肱骨头较易发生关节塌陷。本实验观察到，塌陷部位的关节面及软骨下方小梁骨呈凹陷形，与临床文献报道的关节塌陷改变相符。关节软骨下矿化组织有3种结构，即钙化层、软骨下皮质骨、小梁骨。各种结构在形态学、生理学、力学方面各不相同；在生长、构建、重建过程中，各种结构对机械应力、药物刺激的反应方式也各不相同；而且，每种结构的改变均可能对关节的健康产生独特影响［7］。但是，在以往关于激素性骨坏死的研究中，对软骨下矿化组织结构却未加以区分，尤其是对软骨下皮质骨改变缺乏研究。

　　Clark JM通过扫描电镜观察软骨下管腔内解剖结构，证明为直径介于20～40 μm之间的管道，而且被同心圆排列的骨板层围绕者，无论从哪个方面看都是骨单位内的哈佛管；证明管腔直径>40 μm时，其内所容纳的成分是典型的骨髓［4］。本实验以此为依据，通过区分哈佛管和骨髓腔来区分皮质骨和松质骨，发现A组哈佛管结构明显减少或消失，证明了骨坏死病理改变严重者软骨下皮质骨消失。

　　正常软骨下皮质骨的存在具有重要意义。因为松质骨材料的强度低于皮质骨，钙化层的硬度和强度均较软骨下骨组织明显降低［８］，所以，软骨下皮质骨不但是主要承担载荷的部位，而且对深部小梁骨有保护作用。软骨下皮质骨在承受载荷时具有双重作用：(1)是支撑关节软骨作用；即作为半刚性的床供关节软骨附着；(2)作为承担重量的拱，将载荷从中心接触面向周边传递［9］。

　　据综述文献报道，软骨下方骨组织的微循环是软骨的重要营养来源，对于关节软骨代谢是很重要的。文献认为，与许多报道相反，软骨下区域不但高度血管化而且是脆弱的。这些血管的灌注非常重要，决定了软骨对葡萄糖、氧和水分50％以上的需求［10］。软骨下骨组织的生长是软骨内化骨过程，所以，软骨与软骨下方的骨组织是相互依存的。在软骨内化骨过程中，肥大软骨细胞可转变为骨细胞。初级骨松质中的成骨细胞不断向骨小梁壁上添加骨组织，使骨小梁的网孔逐渐变小，此过程的持续使初级骨松质逐渐成为初级骨密质。

　　本实验发现关节软骨下皮质骨消失、软骨下微循环障碍等病理改变。软骨下皮质骨消失使关节软骨失去了赖以附着的、半刚性的床；软骨下微循环障碍和钙化层细胞减少、消失，导致软骨下骨密质难以形成，代之以多孔结构的松质骨。说明软骨下皮质骨的骨生长和修复能力明显降低甚至丧失。

　　关节软骨下皮质骨消失，关节失去了致密皮质骨构成的桥拱、球拱的重要支撑；深部小梁骨失去了保护；软骨失去了附着床面；当松质骨难以支撑关节时，造成塌陷。

　　骨坏死后发生的软骨下皮质骨缺失，由松质骨支撑软骨；这种改变发生于整个软骨下部，因此，承担重量的拱的消失不是局部的。这种改变具有一定临床意义，能够为临床上激素性骨坏死治疗成功率较低提供解释［１］。

　　(本文附图见加页3)

　　参考文献：

　　［1］  Lieberman JR, Berry DJ, Mont MA, et al. Osteonecrosis of the hip:management in the twentyfirst century［J］. J Bone Joint Surg(Am)，2002，84(5); 834-854.

　　［2］  Kawcak CE, McIlwraith CW, Norrdin RW, et al. The role of subchondral bone in joint disease: a review［J］. Equine Vet J, 2001，33(2):120-126.

　　［3］  Yamamoto T, Hirano K, Tsutsui H, et al. Corticosteroid enhances the experimental induction of osteonecrosis in rabbits with Shwartzman reaction［J］. Clin Orthop，1995, 316:235-243.

　　［4］  Clark JM.The structure of vascular channels in the subchondral plate［J］. J Anat. 1990，171:105-115.

　　［5］  Beishuizen A, Thijs LG. Endotoxin and the hypothalamopituitaryadrenal (HPA) axis［J］.J Endotoxin Res, 2003，9(1):3-24.

　　［6］  Burr DB. Anatomy and physiology of the mineralized tissues: role in the pathogenesis of osteoarthrosis［J］. Osteoarthritis Cartilage, 2004, 12:20-30.

　　［7］  Gupta HS, Schratter S, Tesch W, et al. Two different correlations between nanoindentation modulus and mineral content in the bonecartilage interface［J］. J Struct Biol, 2005,149(2): 138-148.

　　［8］  Wei HW, Sun SS, Jao SH, et al. The influence of mechanical properties of subchondral plate, femoral head and neck on dynamic stress distribution of the articular cartilage［J］. Med Eng Phys, 2005,27(4):295-304.

　　［9］  Imhof H, Sulzbacher I, Grampp S, et al. Subchondral bone and cartilage disease:a rediscovered functional unit［J］. Invest Radiol,2000,35(10):581-588.

　　(第四军医大学西京医院骨科研究所， 西安 710032)