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【摘要】 目的］评价脱细胞脊髓支架的免疫原性，为其在组织工程中的应用奠定理论基础。［方法］将脱细胞脊髓（冻融+3％脱氧胆酸钠+DNase， RNase消化）及新鲜大鼠脊髓分别植入SD大鼠椎旁肌内，于术后1～4周分别取材进行组织学观察，通过HE染色评价炎症反应程度；应用免疫组织化学方法观察移植物及周围组织中的CD3、CD4和CD8阳性T细胞浸润程度，评价免疫排斥反应强度。［结果］组织学观察显示术后均引起周围组织炎症反应，脱细胞组术后1周可见中性粒细胞和淋巴细胞浸润，但2周后只有少量淋巴细胞浸润；新鲜异体脊髓移植组术后1周可见大量中性粒细胞及淋巴细胞浸润，术后4周仍有大量淋巴细胞浸润；与新鲜异体脊髓移植比较，化学去细胞异体脊髓植入后免疫原性明显降低，但仍有轻度细胞介导的免疫反应存在。［结论］移植经化学去细胞处理的异体脊髓后，仅引起轻微的炎症反应和免疫排斥反应，具有良好的组织相容性，并有可能成为良好的脊髓组织工程替代材料。
【关键词】 脱细胞脊髓； 移植， 免疫原性
脱细胞基质作为组织工程支架具有与组织相似的三维结构，因此近年来得到了国内外广大学者的重视。脱细胞技术在周围神经、皮肤、心肌、心瓣膜、膀胱等方面已得到了广泛的应用并取得了较好的效果。脊髓组织与周围神经在结构、质地和组成等方面均存在一定的差异，其结构更为复杂，作者采用冻融+脱氧胆酸钠+DNase,RNase消化法制备的脱细胞脊髓支架经检验后具有与脊髓相似的三维结构，LN（层黏连蛋白）、FN（纤维连接蛋白）等细胞外基质成分得到保存，但尚未对其免疫原性进行检测，本实验旨在进一步研究该支架的免疫原性，以评价其生物安全性，为去细胞脊髓支架在组织工程中的应用奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
SD大鼠（第三军医大学大坪医院实验动物中心）200～220 g，雌雄不拘，脱氧胆酸钠(北京奥博星公司) DNase I、RNase A( 华美生物工程公司)， 恒温回旋振荡器(重庆仪器有限公司)，小鼠抗大鼠CD3和CD8多克隆抗体，免抗大鼠CD4多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)。
1.2 脱去细胞脊髓支架的制备
以戊巴比妥钠将SD大鼠经腹腔麻醉，背部去毛后消毒，取后正中切口，打开椎板，显露脊髓，取胸段脊髓约2 cm。PBS缓冲液清洗，去除表面血迹，参照Ribatti等方法并加以改进［1］：(1)脊髓置于-80℃深低温冰箱中冻存1 h，室温下解冻；(2)将脊髓组织置于蒸馏水内，在室温下浸泡6 h，每2 h换液1次；(3)置于3%的脱氧胆酸钠盐蒸馏水溶液（加入适量1 mol/L NaOH至溶液pH值为8-9）连续震荡4 h（恒温回旋振荡器内持续振荡，25℃ 100 r/min）；(4)蒸馏水中振荡浸泡3 h，1 h换液1次；(5)置于1 KU/ml DNase和RNase混合液中持续振荡30 min；(6)蒸馏水浸泡3 h，1 h换液1次；(7)重复(3)～(6)再萃取1遍，最后将萃取后的脊髓组织置于冷冻干燥机中冻干，60Co照射消毒，照射剂量2.5 Gy，消毒后-80℃冰箱保存。
1.3 实验分组
40只SD大鼠随机分为实验组和对照组，每组20只（n=5）。实验组：SD大鼠20只在脊柱旁开1 cm处椎旁肌内植入1段（2 cm）脱细胞脊髓支架。对照组：于手术当日，另取7只健康成年SD大鼠，用1%戊巴比妥钠麻醉后，无菌条件下取出脊髓约6 cm，等分成3段，在生理盐水中浸泡清洗10 min，然后将与实验组等长脊髓植入到20只SD大鼠的背部椎旁肌内。两组大鼠以1-0缝线缝合肌肉及皮肤，术后分组饲养，每日2次肌注抗生素。观察时间分别为术后1～4周，每组在各时间点观察5只大鼠。
1.4 组织学及细胞免疫排斥评价
实验动物分别术后1～4周取材（n=5），将埋于大鼠背部的去细胞和新鲜的同种异体脊髓连同周围肌肉组织一并切取。部分标本进行石蜡切片，HE染色观察炎症反应及细胞浸润程度；一部分标本进行冰冻切片，切片厚度为8 μm，分别用抗大鼠T淋巴细胞CD3、CD4和CD8多克隆抗体对切片进行免疫组化染色，标记植入神经和周围组织中浸润的T淋巴细胞及其亚群，根据染色的强度判断反应的强弱。
2 结果
2.1 动物术后反应
所有大鼠均顺利成活，无死亡，麻醉清醒后即可自由活动，伤口愈合良好，无红肿及渗出。全部实验无活动异常，饮食正常，大小便正常。
2.2 大体观察
术后1周，实验组的植入物周围组织无明显水肿及渗出，而对照组植入物周围可见较多渗出，组织水肿明显，部分动物移植物被排斥至皮下并出现部分吸收；术后2周，实验组与周围组织无明显黏连，植入物无明显变化，对照组植入物与周围组织黏连明显，植入物明显吸收变短变细；术后3周，实验组植入物周围切开后出血较多，周围无水肿，对照组与周围黏连紧密，进一步吸收变小，周围组织基本无水肿；植入后4周，实验组植入物略有吸收，对照组大部分吸收。
2.3 组织学评价
两组动物在术后1周均可见淋巴细胞及中性粒细胞浸润，并可见成纤维细胞形成，实验组细胞浸润程度明显低于对照组；而且术后2周实验组浸润细胞数量无明显增加，术后4周中性粒细胞已基本消失；而对照组中性粒细胞及淋巴细胞持续增加，至术后4周仍可见大量中性粒细胞及淋巴细胞浸润。
2.4 免疫组织化学分析
实验结果显示实验组：术后1、2周出现少量的CD3+ 、CD4+ 和CD8 +T淋巴细胞群的浸润，术后3、4周无明显增加；对照组移植部位有大量的CD3+，CD4+和CD8+淋巴细胞亚群浸润，阳性细胞染色强度明显高于实验组（图1～6）。
3 讨论
在组织工程的支架材料研究中一种新的趋势是采用天然的脱细胞基质（AECM）作为神经组织的修复材料， AECM具有最接近组织的网架结构、良好的生物力学性能,其表面具备细胞膜受体识别位点、部分活性因子有利于细胞的黏附生长及发挥生理功能，因此是很有实用意义的支架材料。而脱细胞支架材料在具备了良好的三维结构的同时，其免疫原性备受关注。同种异体组织或器官移植的主要问题是免疫排斥反应的问题，其核心问题是MHC，即组织相容性复合体。MHC的表达产物主要存在于细胞膜的表面构成了多种细胞的膜抗原，这是产生移植免疫排斥的主要原因［2］。而包含有LN，FN及Ⅳ型胶原等大分子物质的细胞外基质的免疫原性极低，几乎可以忽略［3］。在细胞免疫中CD4+ T细胞识别与其他细胞表面MHC II类分子结合的肽段，而CD8+ T细胞为细胞毒性T细胞，能识别靶细胞上MHC I类分子结合的抗原肽段。CD4+ 和CD8+ T细胞的强度则与抗原肽-MHC(I类和Ⅱ类)复合物的表达有关。因此，CD4+ 和CD8+ T细胞的强度反映机体对外来抗原免疫应答的强弱。有研究显示异体周围神经去细胞后能够显著降低宿主对移植物的免疫排斥反应［4］，并明显改善神经再生。体液免疫检测结果表明，化学去细胞异体神经的免疫原性显著降低，是相对无抗原性的移植物［5］。本实验结果也同样证实实验组淋巴细胞及中性粒细胞浸润程度明显低于对照组，表明脱细胞脊髓只引起轻微的免疫排斥反应和炎症反应。因此本研究采用冻融+化学萃取法制备的脱细胞脊髓支架不仅去除了细胞及髓鞘成分，保存了细胞外基质的三维结构，而且实验证实具有良好的组织相容性，有可能成为理想的脊髓组织工程支架材料。关于引起免疫排斥反应的原因，在周围神经脱细胞支架的研究中，孙明学等［6］研究认为，诱发免疫反应的物质可能与糖蛋白成分有关。在脊髓脱细胞支架引起轻微免疫排斥反应的原因尚未见报道，有待进一步研究明确引起免疫排斥反应的成分并探索彻底去除引起免疫排斥成分的处理方法。
图1 实验组术后1周支架仍维持网状结构，CD3+细胞明显少于对照组 SABC×400（略）
图2 实验组术后1周支架网状结构存在，CD4+细胞数量明显少于对照组 SABC×400（略）
图3 实验组术后1周，支架仍维持网状结构，CD8+细胞数量明显少于对照组SABC×400 （略）
图4 对照组术后1周组织结构致密，大量CD3+细胞浸润SABC×400 （略）
图5 对照组术后1周，组织结构致密，CD4+细胞明显多于实验组 SABC×400（略）
图6 对照组术后1周，组织结构致密，大量CD8+细胞浸润 SABC×400（略）
【参考文献】
［1］ 郭树章, 任先军, 蒋涛,等. 脱细胞脊髓天然支架的制备及形态学观察［J］.中国矫形外科杂志，2007，15（3）: 225-228.
［2］ Trumble TE, Shon FG.The physiology of nerve transplantation［J］.Hand Clin,2001,16(1):105-122.
［3］ Gulati AK.Immunological fate of Schwann cellpopulated acellular basal lamina nerve allografts［J］. Transplantation,1995,59(11):1618-1622.
［4］ Hudson TW, Zawko S, Deister C, et al．Optimized acelular nerve graft is immunologically tolerated and supports regeneration［J］．Tisue Eng，2004，10(11-12)：1641-1651．
［5］ Rovak JM, Bishop DK, Boxer IX, et al. Peripheral nerve transplantation：the role of chemical acelularization in eliminating allograft antigenicity［J］．J Reconstr Microsurg, 2005, 21(3):207-213．
［6］ 孙明学，唐金树，王 鑫，等.去细胞处理对化学去细胞异体神经免疫原性的影响［J］.中华外科杂志，2006，44(4):275-278.
作者单位：第三军医大学附属新桥医院骨科，重庆市 400037