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【摘要】 ［目的］探讨骨水泥阻塞股骨近中段骨干髓腔后骨内压升高对远侧关节组织结构的影响。［方法］将26只实验兔分成4组，随机取出8只不做模型而作为正常对照组，其余18只采取左侧股骨髓腔内灌注聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）骨水泥而右侧不灌注,制作骨水泥阻塞股骨近中段骨干髓腔的动物模型，根据不同观察时间段随机分成术后4（T4）、8（T8）和16周（T16）3个观察组。对正常对照和模型动物实验侧股骨远端软骨、软骨下骨和滑膜组织标本，采用HE染色、甲苯胺蓝染色、免疫组织化学检测及透射电镜方法进行组织结构观察。［结果］（1） HE染色：关节软骨、软骨下骨和关节滑膜组织损害随时间呈进行性加重，造模16周关节软骨破坏，骨组织结构损害，滑膜组织增生、肿胀。（2） 甲苯胺蓝染色：造模16周关节软骨全层失染。（3） 免疫组化：①Ⅱ型胶原:造模16周软骨细胞染色阳性。②TGFβ1:造模16周软骨细胞染色阳性，关节滑膜细胞染色阳性。（4） 透射电镜：关节软骨和骨细胞损害随时间呈进行性加重，造模16周部分软骨细胞和骨细胞坏死、崩解。［结论］骨水泥阻塞股骨近中段骨干髓腔后导致股骨远端血循环障碍，骨内压升高，持续骨内高压加重了股骨远端的缺血缺氧状态，使股骨远端骨代谢发生紊乱，最终造成股骨远端骨、软骨和滑膜组织发生了退变或坏死。
【关键词】 骨水泥； 骨内高压； 远侧关节； 退变或坏死
目前临床上骨水泥型人工关节的应用仍然非常普遍，而骨水泥型人工关节存在的缺陷可以造成许多并发症〔1、2〕。作者研究发现，骨水泥填塞骨干髓腔后可以导致股骨远端骨内压明显升高并持续存在〔3〕，该改变对股骨远端骨关节的影响很有研究价值。在这里作者模拟骨水泥型人工关节制作了骨水泥阻塞股骨近中段骨干髓腔的兔动物模型〔4〕，重点观察骨水泥阻塞股骨近中段骨干髓腔后对股骨远端关节组织结构的影响情况。
1 材料与方法
1.1 实验动物、药品、材料和仪器
成年新西兰大白兔26只，雌雄不限，体重均在2.6～3.5 kg之间。Ⅱ型胶原一抗（collagen Ⅱ）、TGFβ1一抗（北京中山生物化学技术公司），生物素化山羊抗兔IgG二抗（武汉博士德公司），甲苯氨蓝（25 g/瓶，美国Sigma公司），HE（美国E.M.Chemicals公司）。国产聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate）TJ骨水泥（天津市合成材料工业研究所生产），16#上颌窦穿刺针（外径1.6 mm,内径1.05 mm,长80 mm），日本Olympus公司光学显微镜（BH2型，LM），日本Hitachi公司透射电子显微镜（H600，SEM）。
1.2 动物模型建立方法和分组
采用兔左侧股骨髓腔内灌注骨水泥而右侧作为对照侧的方法。肌注速眠新麻醉后（0.15 ml/kg），俯卧位固定在特制卡压式兔手术台上，采用髋后外方入路，根据兔存在第3转子这个特殊的解剖结构，从股骨后外方肌间隙进入，在第3转子上方仅切除大转子外侧部分而不打断股骨颈，暴露转子间窝，找到骨髓腔入口，用自制的大小合适、粗细不同的髓腔锉反复扩髓后（深度为股骨长度的1/2），反复冲洗创面，冲出破坏的骨髓组织，沙布条沾干。按粉、液比2：1比例调配骨水泥（PMMA），持续手工搅拌，待聚合至面团状态后使用，为避免PMMA填入股骨骨髓腔后深度无法控制，首先将一小块面团状PMMA作成髓腔大小塞状物,用器械轻轻填入髓腔内至股骨中段狭窄处，作为髓腔塞，待10 min PMMA基本固化后，再将其重新调配好（方法同上）呈面团状PMMA，用器械填入股骨髓腔内，直至填满为止。待PMMA完全固化后，缝合关闭切口。将26只实验兔分成4组，除随机取出8只不做模型作为正常对照组外，其余18只均按照上面方法制作骨水泥阻塞骨干髓腔的动物模型，根据不同的观察时间段随机分成术后4（T4）、8（T8）及16周（T16）3个观察组，每组6只。
1.3 标本收集方法
处死正常兔8只，术后4、8及16周组模型兔各6只。其中一半动物取左侧股骨远端关节软骨、软骨下骨、滑膜标本，进行HE染色、甲苯胺蓝染色和免疫组织化学处理，光镜观察。而另一半动物取左侧股骨远端关节软骨、软骨下骨标本，行透射电镜观察。
1.4 普通HE染色方法
取出标本放入10％甲醛固定48 h，8％EDTA脱钙3～4周，乙醇逐级脱水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明，有机溶液浸泡，石蜡纵向包埋，切片机将石蜡块切成4 μｍ厚的薄组织切片，普通HE染色，光镜观察。
1.5 甲苯胺蓝染色方法
切片脱蜡,二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明，乙醇逐级脱水，水洗，甲苯胺蓝染色20 min，水洗，乙醇逐级处理，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明，中性树胶封片（蓝染），光镜观察。
1.6 免疫组织化学检测方法
切片脱蜡；3％过氧化氢室温孵育10 min；水洗；PBS浸泡5 min；0.05%胰蛋白酶37 ℃消化20 min；PBS浸泡3次,每次5 min；10％正常山羊血清封闭，室温孵育10 min；倾去血清，滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育60 min；PBS冲洗3次,每次5 min；滴加适当比例稀释的生物素标记二抗，37 ℃孵育30 min；PBS冲洗3次,每次5 min；滴加适当比例稀释的辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素，37 ℃孵育30 min；PBS冲洗3次,每次5 min；DAB显色，自来水冲洗，苏木素复染，酸酒精分色；中性树脂封片；光镜观察。
1.7 透射电镜样品制备方法
取出标本放入2.5％戊二醛前固定，8％EDTA脱钙3～4周，乙醇逐级脱水，纯丙酮脱水2次，环氧树脂812：丙酮（1∶1）浸透，纯包埋液浸透后固化，超薄切片机切片，铀-铅染色，透射电镜观察。
2 结果
2.1 普通HE染色观察结果
2.1.1 关节软骨组织
对照组软骨表面光滑、平整，分层清晰，软骨细胞排列呈柱状，分布均匀，核大小均匀，着色深，胞浆染色浅，潮标线完整；造模4周软骨表面基本平整，厚度稍减小，软骨细胞排列不规则，分布不均匀，数量减少，潮标线前移、紊乱；造模8周软骨表面不平整，软骨层明显变薄，软骨细胞排列紊乱，有大量的簇聚软骨细胞，数量明显减少，少量细胞坏死，潮标线不清晰或部分断裂；造模16周软骨层明显变薄，表层缺失，呈虫蚀样改变，有深至软骨下骨的裂隙，内见炎性细胞浸润，软骨细胞排列紊乱，数量明显减少，大量细胞坏死，潮标线紊乱或部分缺失。
2.1.2 软骨下骨组织
对照组骨小梁结构正常，骨细胞排列良好，结构完整，板层线清晰；造模4周骨小梁轻度增厚，结构基本正常，部分骨细胞核浓染，空骨陷窝不明显；造模8周骨小梁明显增厚，可见空骨陷窝形成，板层线模糊；造模16周骨小梁形成大量空骨陷窝，部分结构断裂，断裂处有成骨修复现象，骨细胞数量明显减少，板层线消失。
2.1.3 关节滑膜组织
对照组滑膜内层由扁平状或立方形的滑膜细胞覆盖，一般分2～4层，其基部无基膜，细胞间有少量间质与纤维。造模4周滑膜细胞轻度增生、肥大，少量炎性细胞浸润。造模8周滑膜细胞增生、肥大明显，层次增多，滑膜呈绒毛状或乳头状，炎性细胞浸润。造模16周滑膜细胞增生、肿胀严重，细胞间距增宽，炎性细胞大量浸润，纤维结缔组织增生明显，滑膜下血管增生。
2.2 造模16周甲苯胺蓝染色观察结果
对照组软骨组织呈普遍性、均质性蓝染，无失染现象；造模16周关节软骨染色不均匀，失去正常均质性，有严重失染现象。
2.3 造模16周免疫组织化学检测结果
2.3.1 关节软骨组织Ⅱ型胶原染色
对照组软骨细胞染色呈弱阳性；造模16周软骨细胞染色呈阳性。
2.3.2 关节软骨组织TGFβ1染色
对照组软骨细胞染色呈弱阳性；造模16周软骨细胞染色呈阳性。
2.3.3 关节滑膜组织TGFβ1染色
对照组滑膜细胞染色呈弱阳性；造模16周滑膜细胞染色呈阳性。
2.4 透射电镜观察结果
2.4.1 关节软骨组织
对照组软骨组织呈卵圆形，充满于软骨陷窝内，表面微绒毛较多，胞质内有丰富的粗面内质网和发达的高尔基复合体，线粒体较少，胞核大而完整，常染色质丰富，分布均匀。造模4周软骨细胞形态尚好，胞突减少，部分胞浆空胞化，出现脂滴，细胞器数量减少，轻度肿胀，粗面内质网清晰，明显减少。造模8周软骨细胞胞浆局部空胞化，髓样结构形成，部分出现较大脂滴，细胞器肿胀明显，数量减少，粗面内质网扩张，核内异染色质轻度边集，部分核轻度固缩，可见电子密度增高物质。造模16周部分软骨细胞胞核高度固缩，胞膜和核膜无法分清，细胞结构不清晰，胞质坏死、崩解。
2.4.2 软骨下骨组织
对照组骨细胞位于陷窝内，胞体呈扁卵圆形，有较长的突起，胞核呈卵圆形，较大，着色略深，胞浆少而呈嗜碱性，粗面内质网少，高尔基复合体很小，仅有散在的线粒体和游离核蛋白体，线粒体中常有电子致密颗粒；比较活跃的骨细胞体积较大，胞质丰富，内含丰富的粗面内质网、散在的游离核蛋白体、中等量的线粒体、核较发达的高尔基复合体、一些大小不等的囊泡。造模4周骨细胞呈长椭圆形，核内异染色质轻度边集，核周间隙轻度扩大，胞质内线粒体、粗面内质网中度肿胀，部分细胞局部胞质空化。造模8周骨细胞形态改变，胞质浓缩，可见大的空泡，部分细胞有较多的脂滴，胞浆内细胞器肿胀明显，数量明显减少，核内异染色质较多、边集，核周间隙明显扩大。造模16周部分骨细胞体积缩小，细胞边缘不清，细胞膜和核膜连续性中断或消失，胞质成分消失，细胞内电子密度增高。
3 讨论
在骨内高压（IOH）可以引起骨性关节炎（OA）的问题上，目前国内外许多学者的实验和临床研究均证实了这一结论。研究认为骨内高压和骨内微循环淤滞是骨性关节炎发生发展的原发因素，骨内压升高后动、静脉压差缩小，营养血管的血流减少，组织缺血缺氧，渗出增多，破坏了局部组织的正常理化环境，营养障碍引起骨小梁坏死，坏死的骨小梁在修复改建过程中发生骨质硬化，软骨下骨硬化梯度增加，吸收振荡能力降低，使软骨承受的压力增大；同时硬化的软骨下骨还可以作用于关节的构型，影响软骨和骨的顺应性及负重时的最大接触面积。所以关节滑液成分和生化性质的变化、软骨下骨坏死、氧自由基等代谢产物的作用这一系列因素导致关节软骨细胞的代谢出现病理改变，加重了软骨的损害，最终导致退行性改变及骨性关节炎的发生〔5、6〕。
骨水泥阻塞股骨近中段骨干髓腔后骨内压持续升高使骨髓内血液流动处于淤滞状态，加重骨内静脉引流障碍和组织受压，引起一系列血流动力学变化，血液淤滞进一步加重，形成恶性循环〔7〕。淤血的骨质得不到动脉血，继续发展，就会发生不可逆的骨质缺血坏死；骨内压升高，骨内静脉淤滞，骨内静脉窦扩张，形成囊变、骨硬化以及骨小梁增粗等病理变化，由骺端累及骨端关节面以至于形成骨关节病。股骨内压的改变可以引起膝关节内压和胫骨内压的变化，并形成互为结果的恶性循环，而引起膝关节的滑膜炎改变，继而引起滑膜、滑液、软骨、软骨下骨等组织的类似改变，并出现一系列临床表现，进一步加速和加重骨关节病发生的程度〔8、9〕。另外骨水泥的毒性反应、放热反应、溶骨反应引起的一系列破坏也在这种变化中发挥了一定的作用〔10、11〕。尽管在这个过程中有骨和软骨组织的修复和重建现象存在，但是由于血供恢复和组织的修复过程过于缓慢，使得许多骨、软骨和滑膜组织发生了退变或坏死，最终甚至导致了骨性关节炎的发生。
从作者实验结果看，骨水泥阻塞股骨近中段骨干髓腔后骨内压升高对股骨远端关节软骨、软骨下骨和滑膜组织均造成了明显影响。通过对组织形态学和超微结构的观察，骨水泥阻塞股骨近中段骨干髓腔后，股骨远端的组织结构随时间的延长其损伤程度逐渐加重，16周时已经造成了软骨和滑膜组织退变和部分骨和软骨细胞的坏死。实验中甲苯胺蓝染色的结果显示模型动物关节软骨中有明显失染现象存在，说明软骨内蛋白多糖的含量明显减少，软骨细胞发生了退变；免疫组织化学染色Ⅱ型胶原和转化生长因子（TGFβ1）在模型动物关节软骨和滑膜组织中呈阳性表达，说明损伤的软骨和滑膜正处于退变和修复重建交替过程中。以上结果说明骨水泥阻塞股骨近中段骨干髓腔后，如果不给予其他处理，其远侧关节的骨、软骨和滑膜组织将发生退变或坏死，最终将可能导致骨性关节炎的发生。以上这些结果为临床骨水泥型人工关节的应用，提供了一个初步的认识，提示人们在进行骨水泥型人工关节置换手术时，必须考虑人工关节的远期影响问题。
（本文附图见加页3）（略）
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作者单位：广西壮族自治区人民医院骨科,南宁 530021；重庆医科大学第一附属医院骨科,重庆 400016；广西壮族自治区人民医院门诊输液室,南宁 530021