脊髓损伤后低剂量FK506对伤段组织电解质水含量失衡的早期保护作用

【摘要】  ［目的］探讨脊髓损伤后早期应用低剂量抗移植排斥药物—FK506对伤段脊髓组织钙、镁离子及水含量的影响，明确其神经保护作用的可能机制。［方法］35只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、损伤组和治疗组。采用Allen's打击法制作脊髓损伤模型，对照组仅做椎板切除术。治疗组在脊髓损伤后5 min一次性经尾静脉注射FK506(0.3 mg／kg)，其余两组以相同方法给予0.9％的生理盐水。术后6、12、24 h取材，采用干湿法测定伤段脊髓组织水含量，以原子吸收光谱分析法测定钙、镁离子含量。［结果］伤段脊髓组织中水含量及钙离子水平升高，两者均于伤后12 h达高峰，而镁离子水平降低，应用FK506可显著改善上述变化(P<0.05，P<0.01)。［结论］低剂量FK506可减轻伤段脊髓组织水肿和电解质失衡，对继发性脊髓损伤具有神经保护作用。

【关键词】  脊髓损伤；钙；镁；水肿；神经保护药

　　Early protective effect of lowdose tacrolimus on imbalance of electrolyte and water in injured spinal cord tissue in rats

　　PAN Feng, ZHU Chengliang, CHEN Anmin, et al.

　　Department of Orthopaedics, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of　Science and Technology, Wuhan 430030, China
   
　　Abstract：［Objective］To study the effect of lowdose tacrolimus on calcium, magnesium and water content in injured spinal cord tissue and to elucidate the neuroprotective mechanism.［Method］Thirtyfive male rats were divided randomly into three groups: the control group, the　injury group and the tacrolimustreated group, and the latter two groups were subjected to　contusion SCI at the T10 vertebrae level with a weightdrop impactor (10 g weight was dropped　from a 4.0 cm height). The tacrolimustreated group was injected with tacrolimus 5 minutes after SCI, while the other groups received 0.9 % saline likewise. The rats were sacrificed at 6, 12, 24 h following SCI. The water content and the values of calcium and magnesium in injured spinal cord tissues were measured by using drywet method and atomic absorption spectrometry respectively.［Result］The water content and the value of calcium in injured spinal cord tissues were on the rise and both reached their climax at 12 h after SCI, while the value of magnesium went down. The imbalances in the tacrolimus-treated group were remarkably ameliorated compared with the injury group (P<0.05,P<0.01). ［Conclusion］Lowdose tacrolimus can attenuat e edema and electrolyte imbalance of injured spinal cord tissue and possess neuroprotective effect on secondary spinal cord injury in rats.
   
　　Key words：spinal cord injury;  calcium;  magnesium; edema;  neuroprotective agents
 
　　急性脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)后如何防止继发性损伤的发生、发展一直以来都是脊髓损伤研究的热点。现己明确，脊髓损伤后伤区微循环障碍、电解质失衡所致的组织水肿及代谢紊乱在继发性损伤中扮演着重要角色，特别是细胞内钙离子超载被认为是神经细胞死亡的“最后通道”［1］。许多学者以此为突破点，在脊髓损伤的药物治疗方面进行了有益的探讨。近年来，临床广泛应用的抗移植排斥反应药物-FK506(Tacrolimus)在神经保护方面的作用已被证实［2］。本研究拟从脊髓损伤后的生化改变层面探讨FK506对伤段脊髓组织中钙、镁离子及水含量的影响，明确其神经保护作用的可能机制。

　　1材料与方法

　　1.1实验动物分组
   
　　35只成年雄性健康Wistar大鼠，体重220～280 g，由武汉大学实验动物中心提供。随机分为3组，治疗组：15只大鼠，脊髓损伤后5 min 一次性经尾静脉注射FK506(0.3 mg/kg)；损伤组：15只大鼠，脊髓损伤后5  min 一次性经尾静脉注射等量生理盐水；对照组：5只大鼠，椎板切除术后 5 min 一次性经尾静脉注射等量生理盐水，不损伤脊髓，作为正常对照。

　　1.2  脊髓损伤模型制作
   
　　大鼠经1％戊巴比妥钠(30 mg／kg)腹腔内注射麻醉，损伤组和治疗组采用Allen's法建立脊髓损伤模型：切除T9～T10棘突和椎板，暴露硬膜囊，重10  g的金属棒从4.0 cm高处自由落下，撞击硬膜囊，撞击能量为4.0 cm×１0 g，损伤直径约为3.0 mm，金属棒下落后大鼠迅速出现摇尾反射，双后肢及躯体回缩扑动后双后肢呈弛缓性瘫痪，表明撞击成功，止血后缝合切口。对照组仅行T9～T10椎板切除术。术后小心饲养，每8 h人工按压排尿。

　　1.3  取材
   
　　治疗组与损伤组分别于术后6、12、24 h处死动物，每个时间点各5只，于原切口显露脊髓损伤区，以打击处为中心迅速取出伤段脊髓组织长约10 mm，先以冷生理盐水将其表面血迹冲洗干净，轻柔去除硬脊膜，滤纸吸干表面液体后，装入称样杯中，以电子天平称取湿重，之后置于-20℃冰箱备用。对照组5只大鼠以相同方法取材备用。

　　1.4  组织水含量测定
   
　　将冻存标本取出，放入电动恒温鼓风干燥箱中，于96±2℃下干燥48 h至恒重(2次称量值之差<0.2 mg)后称取干重，按公式计算组织水含量：组织水含量=(湿重-干重)／湿重×100％。

　　1.5 钙、镁离子含量测定
   
　　向装有干燥标本的瓶中加入浓硝酸、高氯酸混和溶液5 ml(体积比5∶2)，常温消化48 h，将消化后溶液移入烧瓶中，再放入500℃左右的石棉炉，使样本无机化。用5％盐酸溶液将烧瓶中的无机物溶解后，将溶液移入25 ml容量瓶，定容后用原子吸收分光光度计测定钙、镁离子含量，脊髓组织中钙、镁离子含量(μmol／g干重)=测定液钙、镁离子浓度／样本干重×稀释倍数，测定波长：Ca2+为422.7 nm，Mg2+为289 nm。

　　1.6 统计学处理
   
　　采用正版统计分析软件SPSS 12.0进行处理，计量资料以均数±标准差(±s)表示，两组间比较用t检验，Ｐ<0.05为差异有统计学意义。
   
　　2 结果

　　2.1 伤段脊髓组织水含量
   
　　对照组大鼠脊髓组织中水含量平均为(63.35±1.70)％。损伤组大鼠伤段脊髓组织中水含量于伤后6 h即有明显升高，迅速上升至伤后12 h达高峰，之后12～24 h稳定在相对较高的水平上。治疗组大鼠脊髓组织中水含量在伤后6 h亦有升高，但明显低于损伤组水平(P<0.01)，峰值也出现在伤后12h，显著低于同时间点损伤组(P<0.05)，之后渐趋下降，至伤后24 h水含量明显低于损伤组(P<0.01)。见表1。表1 大鼠SCI后各时间点伤段脊髓组织水含量(略)注： 与损伤组比较 ＃P<0.05; *P<0.01

　　2.2 伤段脊髓组织钙、镁离子含量
   
　　对照组大鼠脊髓组织中Ca2+含量平均为(9.45±0.83)μmol／g干重。损伤组大鼠伤后6 h脊髓组织中Ca2+含量大幅度升高，达对照组水平2倍有余，伤后12 h上升至峰值，随后缓慢下降。治疗组大鼠伤后各时间点Ca2+含量明显低于损伤组(P<0.01)，高峰也发生在伤后12 h(表2)。对照组大鼠脊髓组织中Mg2+含量平均为(9.61±1.57)μmol／g干重。伤后6 h损伤组和治疗组大鼠脊髓组织中Mg2+含量均有明显降低，但两者无显著性差异(P>0.05)，伤后12～24 h两组大鼠脊髓组织中Mg2+含量总体处于上升趋势，但在损伤组Mg2+含量恢复缓慢，基本停滞于5.9μmol／g干重左右，而治疗组Mg2+含量上升幅度明显，24 h内升高近2 μmol／g干重，两组间比较在伤后12、24 h有显著性差异(P<0.
05)(表3)。表2  大鼠SCI后各时间点伤段脊髓组织Ca2+含量(略)注：与损伤组比较 ＃P<0.01表3  大鼠SCI后各时间点伤段脊髓组织Mg2+含量(略)注：与损伤组比较 ＃P<0.05

　　3  讨  论
   
　　FK506是一种可从streptomyces tsukubaensis中提取的大环内酯类抗生素，通过与相应内源性亲免素FK506结合蛋白(FK506 binding protein，FKBP)结合形成复合物而抑制钙调神经磷酸酶(calcineurin，CaN)介导的T细胞活化，阻碍T辅助细胞释放IL2及T杀伤细胞的增殖，从而抑制细胞和体液免疫反应，具有调节免疫应答的作用，是目前临床上用于控制器官移植排斥反应的一线药物［3］。而近年研究发现，FK506与FKBP12形成的FK506FKBP12复合物，通过抑制CaN的活性而发挥神经保护和促神经再生作用。如Macleod和Butcher［4］的研究表明，FK506FKBP12复合物通过作用于CaN，阻断其介导的一氧化氮合酶(nitric　oxide　synthase，NOS)活化，减少NO的神经毒性，从而对损伤局部的神经组织起到保护作用。Keswani等［5］的研究则发现，FK506通过抑制CaN而提高生长相关蛋白-43(growthassociated　protein 43，GAP43)的活性，从而发挥促神经再生作用。而LopezVales等［2］则在大鼠脊髓损伤模型中进一步证实FK506可缩小继发性损害面积，提高脊髓功能恢复。以上研究表明，FK506极有可能继甲基强的松龙之后为脊髓损伤的药物治疗开辟新的可能途径。而同时笔者也注意到，在目前关于此种神经保护药物(neuroprotective agent)的研究中，偏重于从组织病理学和行为学角度探讨FK506发挥神经保护作用的机制，而对于脊髓损伤后早期生化改变有何影响甚少涉及。不可否认的是，脊髓损伤后迅即发生的伤区微循环障碍、电解质失衡等所致的组织水肿及代谢紊乱在继发性损伤中扮演着重要角色，明确FK506对上述生化改变的影响正是本研究意义所在。
   
    从本实验所测生化指标来看，在脊髓损伤后24 h内，伤段脊髓组织水含量显著增加，尤以伤后12 h为著，表明伤后早期脊髓组织发生了继发性水肿，而此时局部组织的Mg2+含量显著降低，并且在伤后24h内基本处于停滞不升的状态；另一方面，在脊髓损伤后早期给予FK506，局部组织在伤后24 h内的含水量有明显降低，而Mg2+含量在伤后12～24 h有较大幅度恢复。这可以说明：(1)Mg2+的含量变化与脊髓继发性水肿的程度呈负相关；(2)脊髓损伤发生后局部组织难以通过自身调节机制将Mg2+含量恢复至正常水平；(3)伤后早期给予FK506可促进伤段脊髓组织Mg2+水平的恢复，有助于防止脊髓继发性水肿的恶化。Akino等［6］的实验也表明脊髓损伤后局部组织Mg2+含量下降，而且Mg2+的下降程度与脊髓组织损伤程度成正相关，与本实验结果相互印证，说明Mg2+的降低可能参与了脊髓的继发性损伤过程；在脊髓损伤后若早期补充Mg2+或以适当药物促进Mg2+含量恢复便可减轻这种因Mg2+水平下降造成的继发性损伤。Mg2+是一种非竞争性的N-甲基-D-天冬氨酸(NmethylDaspartate，NMDA)受体拮抗剂，它可阻滞NMDA受体上的离子通道，并抑制兴奋性氨基酸(excitatory amino acid，EAA)的释放［7］，从而拮抗由EAA所致的损伤。另外Mg2+对脊髓损伤的保护作用还可能有赖于对Ca2+的拮抗作用。脊髓损伤直接引起细胞膜对Ca2+的通透性增加，并导致Ca2+清除功能障碍，Ca2+大量内流并在胞内聚集引起细胞内Ca2+超载。细胞内高钙可以激活多种蛋白酶及磷脂酶A2，产生大量病理性自由基参与脂质过氧化反应，细胞器及膜结构广泛受损；Ca2+亦参与微血栓形成，并收缩微血管导致局部微循环障碍；大量Ca2+内流沉积于线粒体，致能量代谢紊乱，还可增加胞膜对其他离子的通透性，使胞内Na+聚集，引起细胞水肿［8］。本实验观察到在脊髓损伤24h内，伤段脊髓组织中Ca2+含量显著增高，与脊髓继发性水肿发生的时间和严重程度相平行。因此正如Yang等［1］所指出，脊髓损伤后Ca2+内流所致胞内Ca2+浓度升高是脊髓损伤时神经细胞死亡的最终共同通路。而Mg2+通过与Ca2+竞争细胞膜上的结合位点而抑制Ca2+内流；通过促进Mg2+-Na+交换从而抑制Ca2+-Na+交换，阻止Ca2+内流；细胞外Mg2+尚可通过Mg2+-Ca2+交换促进Ca2+外流。如Saeki等［9］报导在脊髓缺血性损伤前20 min给予Mg2+能减轻脊髓继发性病理损害，同时伤后24 h内的神经损伤严重度评分与对照组相比显著降低。本实验中应用FK506治疗后局部组织Mg2+含量升高，Ca2+含量显著降低，而脊髓继发性水肿明显改善亦为其神经保护作用提供了佐证。但本研究中观察到的Ca2+含量下降确是由Mg2+的拮抗作用所致，抑或是由FK506直接抑制引起，与Mg2+含量升高只是一种反向伴随关系还有待进一步实验证实。
   
    在本实验中伤后早期给予FK506只能减轻，并没有完全逆转伤段脊髓组织继发性水肿及Ca2+、Mg2+离子失衡等病理变化，主要可能由于脊髓损伤是一个多环节的复杂过程，其治疗应联合用药，从各个方面阻滞损伤环节，才能获得最大疗效。此外，鉴于脊髓继发性水肿和钙离子超载的高峰期均发生于伤后12 h，因此要取得预期效果，FK506用于脊髓损伤治疗的时间窗宜控制在伤后12 h内。

【参考文献】
  　　［1］Yang Y, Piao Y. Effects of resveratrol on Ca2+, Mg2+-ATPase activities after spinal cord trauma in rats［J］. Zhong Yao Cai, 2002, 25(12):882-885.

　　［2］LopezVales R, GarciaAtias Ｇ， Fores J, et al. FK506 reduces tissue damage and prevents functional deficit after spinal cord injury in the rat［J］. J Neurosci Res, 2005,81(6):827-836.

　　［3］Nito C, Kamiya T, Ueda M, et al. Mild hypothermia enhances the neuroprotective effects of FK506 and expands its therapeutic window following transient focal ischemia in rats［J］. Brain Res, 2004, 1008(2): 179-185.

　　［４］Macleod MR, Butcher SP. Nitricoxidesynthasemediated cyclic guanosine monophosphate production in neonatal rat cerebenar prisms is resistant to calcineurin inhibition［J］. Neurosci Lett,2002, 322(1): 41-44.

　　［5］Keswani SC, Rosenberg B, Hoke A. The use of GAP43 mRNA quantification in high throughout screening of putative neuroprotective agents in dorsal root ganglion cultures［J］. J Neurosci Methods,2004,136(2): 193-195.

　　［6］Akino M, O'Donnell JM, Robitaille PM, et al. Phosphorus31 magnetic resonance spectroscopy studies of pig spinal cord injury. Myelin changes, intracellular pH, and bioenergetics［J］. Invest Radiol, 1997, 32(7): 382-388.

　　［7］van den Bergh WM, Algra A, van Kooten F, et al. Magnesium sulfate in aneurysmal subarachnoid hemorrhage: a randomized controlled trial［J］. Stroke, 2005, 36(5): 1011-1015.

　　［8］蔡卫华，叶晓健，谭炳毅，等.急性脊髓损伤后内皮素-1与Ca2+含量的变化关系的研究［J］.中国矫形外科杂志，2004,12(20): 1568-1570.

　　［9］Saeki H, Matsumoto M, Kaneko S, et al. Is intrathecal magnesium sulfate safe and protective against ischemic spinal cord injury in rabbits［J］. Anesth Analg,2004, 99(6):1805-1812.

作者单位：1．华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，武汉 430030； 2．武汉大学生命科学院，武汉 430072