可降解复合人工骨修复骨缺损的实验研究

【摘要】  ［目的］探讨硫酸钙（CS）/骨基质明胶（BMG）复合人工骨修复节段性骨缺损的能力。［方法］分别制备CS、BMG，按一定比例复合，植入兔尺骨15 mm骨缺损，并随机分为3组，CS/BMG组植入复合人工骨、CS组单纯植入硫酸钙、空白对照组缺损区旷置。标本于术后4、8、12周分批取材，经大体观察、影像学、组织学及四环素荧光示踪检测，观察修复骨缺损的效果。［结果］术后切口均一期愈合，植入区周围未见炎性细胞浸润。CS/BMG组植入4周，缺损区两端及中央均可见岛状新骨生长，8周时材料已完全降解，新骨生长活跃，并逐渐由编织骨重塑为板层骨，12周缺损区被新生骨替代，骨结构逐渐成熟，与宿主骨间形成骨性桥接，髓腔再通，完成骨性修复。CS组4周两端也见新骨生长，但较CS/BMG组成骨量少，中央部位新骨出现时间晚。8周时材料完全降解吸收，植入区可见大量骨痂生长，两端出现板层样新骨，12周缺损区得到基本修复，但骨髓腔轮廓不清。空白组术后形成骨不连。［结论］。CS/BMG复合人工骨具有良好的生物相容性和可降解性，能有效地修复兔尺骨骨缺损，是一种较为理想的骨移植替代材料。

【关键词】  硫酸钙；骨基质明胶；人工骨；骨缺损；骨移植

    Experimental study on treatment of bone defects with calcium sulfate containing bone matrix gelation∥CHEN Jianmin,LIU Fanggang,JIN Dadi.Department of Orthopaedics,the 359thHospital of PLA,Zhenjiang,Jiangsu 212001,China

    Abstract：［Objective］To investigate the osteogenetic effect of calcium sulfate（CS）combined with bone matrix gelatin（CS）as bone substitute material in a rabbit ulnar defect model.［Method］Twenty one adult New Zealand White rabbits were used.The segmental ulnar defects of 15 mm were created b/laterally and were divided into tbree groups:Group 1,defects were filled with CS/BMG;Group 2,defects were filled with CS;Group 3,untreated control defects.The samples were harvested at 4,8,12 weeks and were examined by radiographic,histomorphological and tetracycline tracing analysis.［Result］No inflammatory or foreign body reaction was observed around all the defects.Both CS/BMG and CS were almost completely resorbed 8 weeks postoperation.At the group 1,nem bone was found throngbout the defects after 4 weeks.All defects were repaired with a wellorganized traheeular pattern and a thin neocortex after 12 weeks.At the group 2,mass of new bone tissue formed at the periphery of the defect 4 weeks postoperatlon,but the development of new bone at the central of the defect was latter than that at the group 1.At 12 weeks,all defects were bridged by new bone tissue with little adjacent medullary bone.At the group 3,slight new bone was observed at the periphery of the defect region,and the defects were filled with fibrous tissue.［Conclusion］Calcium sulfate containing bone matrix gelatin is totally bioresorbable and biocompatible.The compound material can enhance the repair bone defects effectively as a bone graft substitute.

    Key words：calcium sulfate;  bone matrix gelation;  artificial bone;  bone defect;  bone transplantation

    骨缺损的修复重建是矫形外科领域的重点课题之一。自体骨被公认为骨移植的“金标准”，但其来源有限，且取骨处存在较高并发症，临床应用受限。长期以来，人们不断探索以寻找理想的骨移植替代物。众多实验证实，硫酸钙具有良好的生物相容性及可降解性，是一种良好的骨传导材料〔1、2〕，但单一硫酸钙缺乏骨诱导活性，仍不能满足临床需要。本实验将分别自制硫酸钙（calcium sulfate，CS）与骨基质明胶（bone matrix gelatin，BMG），按一定比例复合，综合各材料的性能优势，制备既具有骨诱导活性，又具有骨传导作用的生物活性复合人工骨，通过动物实验，观察其骨缺损的修复能力，为临床应用提供理论依据。

    1  材料与方法

    1.1  材料的制备〔3〕

    1.1.1  自制硫酸钙  取高纯度二水硫酸钙，在一定条件下脱去1.5个水分子，生成α半水硫酸钙，经干燥、粉磨后，置于干燥容器中贮藏备用。

    1.1.2  骨基质明胶  参照金大地的方法〔4〕，取兔新鲜四肢长骨干，去除软组织、骨膜、骨髓，液氮速冻，粉碎并筛取30～80目骨粒。室温下，1∶1氯仿甲醇溶液脱脂；0.6 mmol/L盐酸脱钙；反复洗涤除酸后，再脱脂1次，自然挥发；然后依次以2mmol/L CaCl2、0.5 mol/L EDTA，8 mmol/L LiCl分别处理；55 ℃水浴24 h；冻干备用。

    1.1.3  复合材料的制备  将粉状硫酸钙与骨基质明胶颗粒按2∶1比例复合，充分混和，以固液比1∶0.5加入注射用蒸馏水，调拌至糊状后，立即注入模具内，常温常压下，预制成直径5 mm、长15 mm的圆柱状人工骨，环氧乙烷消毒备用。

    1.2  动物模型

    1.2.1  实验动物分组  健康成年新西兰大白兔21只（由南方医科大学实验动物中心提供），体重2.5～3.5 kg，雌雄不限,制作双侧尺骨缺损模型，按随机化原则分为3组，CS／BMG组15肢，植入复合人工骨；CS组15肢，单纯植入硫酸钙；空白对照组12肢。术后4、8、12周分批取材，各时间点7只兔14侧术肢。

    1.2.2  手术方法  2.5％戊巴比妥钠静脉麻醉，将大白兔仰卧位固定，双前肢脱毛，消毒，铺无菌单。前臂后外侧纵切口，长约3 cm，依次切开显露尺骨中段，截除尺骨1.5 cm（含骨膜），造成尺骨干节段性骨缺损，将预制材料植入骨缺损内，空白对照组不植入任何材料，逐层缝合切口。

    1.2.3  术后处理  术后分笼饲养，每只肌注青霉素40万单位，1次／日，连续3 d。按4、8、12周不同时间点处死动物，以骨缺损区为中心，截取2.5 cm长尺骨（缺损远近端各保留0.5 cm）。

    1.3  观察指标

    1.3.1  大体观察  观察动物术后饮食、活动及伤口反应情况，及标本新骨与宿主骨界面结合情况。

    1.3.2  X线检查  于术后当天及各时间点摄双侧尺桡骨正位片，曝光条件为40 KV、50 mA、0.2 s，投照距离为75 cm，观察骨痂生长和骨连接情况。

    1.3.3  组织学观察  标本以中性福尔马林（10％）／EDTA（10％）混合液固定、脱钙1个月后，脱水、石蜡包埋，纵形切片，HE染色，光镜下观察成骨情况。

    1.3.4  四环素荧光示踪  分别于动物处死前1周及3 d静脉注射3％盐酸四环素，40 mg／kg，标本以10％中性福尔马林固定后，乙醇梯度脱水，甲基丙烯酸甲酯包埋，硬组织切片机沿纵轴20 μm连续切片，荧光显微镜下观察矿化情况。

    2  结  果

    2.1  大体观察  麻醉清醒后，所有动物均恢复正常饮食，精神状况良好；术肢切口无红肿、渗出等炎性表现，切口均一期愈合；12周时，CS／BMG组术后缺损区完全被新骨替代，新骨与宿主骨界限消失；CS组缺损区骨痂明显，但尚未完全骨化；空白组缺损区未见骨痂生长。取材时植入材料周围组织均未见变性、坏死。

    2.2  X线检查  术后当天X线片见尺骨截骨端整齐，材料位置良好，界面清晰，硫酸钙人工骨呈高密度影，密度高于宿主皮质骨，CS／BMG复合人工骨呈点状高密度影，材料密度介于皮质骨与松质骨之间。CS／BMG组4周时材料大部分降解吸收，显影不清，缺损区有明显骨痂形成；8周时骨缺损区密度增加，新生骨与宿主骨界面模糊，完成断端间的骨性桥接，12周见缺损区被新骨完全替代，骨痂开始塑形，髓腔再通，新生骨密度略低于正常骨质（图1）。CS组术后4周可见少许新骨形成，缺损区两端明显，但骨痂形成量较CS／BMG组少；8周时缺损区新骨形成增多，骨缺损范围减小；12周新骨形成量进一步增加，骨缺损得到初步修复，断端间新骨形成骨桥，与宿主骨界面模糊，但尚未见到髓腔再通（图2）。空白组4、8周均只有少量新骨形成，且局限在骨缺损两端，12周断端髓腔封闭、硬化，形成骨不连（图3）。

    图1CS/BMG组术后当天  1a.4周；1b.8周；1c.12周；1d.尺骨缺损X线片  图2CS组术后当天  2a.4周；2b.8周；2c.12周；2d.尺骨缺损X线片  图3空白对照组术后当天  3a.4周；3b.8周；3c.12周；3d.尺骨缺损X线片2.3  组织学观察

    术后4周CS／BMG组植入材料大部分已降解吸收，剩余人工骨裂解成颗粒状或散在岛状，原始形态消失，缺损两端及中央均可见大量软骨细胞及骨细胞，呈片状或岛状；随着时间的延长，8周时材料吸收部位骨细胞增殖活跃，新骨相互连接成片状，逐渐由编织骨重塑为板层骨，并有血管长入，形成髓腔样结构；12周缺损区被新生骨替代，新骨进一步重建，骨结构逐步成熟，新骨与宿主骨形成骨性连接，皮质骨连续，髓腔再通，完成骨性修复，其间未见纤维组织长入（图4）。CS组术后新骨形成量较CS／BMG组减少，4周只见缺损两端有新骨生成，材料吸收部位有大量成熟的软骨细胞；8周时材料已完全吸收，镜下观察未见有材料残余，植入区可见大量的软骨细胞、骨细胞，两端明显，少量新骨形成板层样结构，髓腔样结构开始出现；12周新骨逐渐增多，两端与宿主骨之间形成骨性桥接，植入中央也可见大量编织骨，并与两端汇合（图5）；空白组术后仅在植入两端见少量新骨生长，12周宿主骨断端髓腔封闭，缺损中央未见新骨生长，代之以大量纤维结缔组织填充。各组各时间点均未见植入区周围有炎性细胞聚集。

    2.4  四环素荧光示踪

    CS／BMG组4周时，植入区可见金黄色荧光带，呈散点状，断端较缺损区中央明显，提示有新骨长入；8周时荧光带较前明显，缺损区中央也可见明亮的荧光；12周缺损区见广泛呈片状的荧光，及明显“双轨征”（图6）。CS组4周断端见少量点状荧光，8、12周缺损区两端及中间均可见条片状荧光，但较CS／BMG组少（图7）。空白组8周及12周均只在骨断端见稀少的荧光。

    图4CS/BMG组术后组织学观察  4a.术后4周（HE×200）；4b.术后8周（HE×400）；4c.术后12周（HE×100）；4d.术后12周（HE×200）  图5CS组术后组织学观察  5a.术后4周（HE×200）；5b.术后8周（HE×200）；5c.术后12周（HE×100）；5d.术后12周（HE×200）  图6CS/BMG组术后四环素荧光示踪  6a.术后8周（荧光显微镜  ×100）；6b.术后12周（荧光显微镜  ×100）  图7CS组术后四环素荧光示踪  7a.术后8周（荧光显微镜  ×100）；7b.术后12周（荧光显微镜  ×100）

    3  讨  论

    理想的骨移植材料需在缺损区提供一个稳定的空间环境，诱导新骨形成，且材料能同步降解吸收，促进骨缺损的修复重建。自1892年德国外科医生Dreesman报道成功应用硫酸钙修复骨缺损以来，人们对硫酸钙进行了不断的探索，作为骨移植替代物，目前已广泛应用于骨科、整形外科、口腔科等领域。硫酸钙是一种无机化合物，在体外复合细胞培养实验中，表现出良好的组织相容性，成骨细胞可完全贴壁，并增殖旺盛，破骨细胞可吞噬吸收材料〔5、6〕。动物实验也证实，硫酸钙修复骨缺损术后，材料周围未见炎性细胞积聚，数周后新生骨与宿主骨组织直接连接，无纤维结缔组织包裹，周围组织间未见明显异物反应、急性或慢性炎症反应，组织相容性好〔7、8〕。本实验中所有动物伤口均一期愈合，术后植入区周围无组织变性、坏死，未见纤维结缔组织包裹，镜下也未见炎性细胞积聚，与文献报道结果一致。术后4周，影像学及组织学检测提示材料大部分已降解吸收，切片见剩余人工骨裂解成散在状，原始形态消失；8周时X线片已无材料阴影，镜下观察也未见有材料残余，证实硫酸钙人工骨能完全生物降解吸收，降解时间根据植入位置及大小形状，通常为4～8周，与新骨形成时间相似〔5、8〕。本实验组织学观察显示，植入硫酸钙人工骨后，新骨自缺损两端长入，随着时间的延长，逐渐汇合于中央部位，提示硫酸钙在骨缺损部位起传导成骨作用。硫酸钙吸收降解的同时，新骨生长并塑形，硫酸钙溶解所产生的钙离子参与提供骨生长的物质基础〔6、9、10〕。尽管硫酸钙具有良好的生物相容性和可降解性，但作为骨传导材料，并不具有诱导成骨能力，发挥作用有限〔11〕。为此，有必要引入诱导成骨活性成分，进一步增强骨缺损的修复能力，拓宽人工骨的应用范围。

    BMG是一种天然生物材料，由同种或异种骨经一系列物理化学处理制得。在制备过程中，去除了骨形成蛋白之外的95％非胶原性蛋白和脂类，在保留诱导成骨活性的基础上，抗原性大为降低〔12〕。众多实验研究证明，BMG含有骨形态发生蛋白（BMP），植入生物体内后，不发生免疫反应，具有较高的诱导成骨活性，其成骨能力强于脱钙骨基质，甚至有报道与自体骨效果相当，且结构松散，易使新生血管及细胞长入〔13、15〕。本研究将硫酸钙、BMG物理复合，制备具有一定力学强度的新型复合人工骨，综合各材料的性能优势，通过传导成骨及诱导成骨双重机理修复骨缺损。实验中，在复合人工骨植入早期（4周），即可在缺损区两端及中央发现有新骨同步形成，生成的骨量较单纯植入硫酸钙多，中央区出现新骨时间早，12周已基本完成修复，成骨效果明显优于硫酸钙人工骨。材料植入动物体内未见异物排斥反应发生，在缺损区起三维支架作用，为新骨生长提供了稳定的空间环境，同时，BMG诱导缺损区周围环境中的间充质细胞向软骨细胞、骨细胞分化、增殖。随着硫酸钙的吸收降解，血管长入，空间被新生骨爬行替代，材料内部的BMG进一步发挥诱导成骨活性，新骨逐渐达到材料内部并汇合，完成骨缺损的修复。

    4  结  论

    CS／BMG作为新型可降解复合人工骨，其制备材料来源广泛、价格低廉，且操作方便易行，实用性强。在动物实验中表现出良好的生物相容性，可完全生物降解吸收，降解速率与新骨形成相一致，能有效地修复骨缺损，是一种充满前景的骨移植替代材料。

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作者单位：1.解放军第359医院骨科，江苏镇江 212001；2.南方医科大学南方医院脊柱骨病外科，广州 510515