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【摘要】 ［目的］通过建立切断组成大鼠坐骨神经的不同成分、联合胫骨骨折的动物模型，来研究感觉/运动神经损伤对骨折愈合的影响，并进一步探讨周围神经系统对骨组织的生理作用。［方法］Wistar大鼠90只平均分为3组：对照组，运动神经（前根）切断组，感觉神经（后根）切断组，选择性切断一侧L4～6神经根。所有大鼠于神经根暴露侧/切断侧胫骨造成横行骨折，髓钉固定。30 d后取大鼠双侧胫骨，测患侧胫骨近端骨密度、在影像学资料上测量患侧骨痂宽度及健侧胫骨相应位置的皮质宽度、取所有大鼠双侧胫骨行湿重称量、骨痂组织学切片观察、双侧胫骨行生物力学拉伸测试。所得结果均以患侧数据除以相应健侧数据得出一相对数，以相对数数据进行统计分析。［结果］患侧胫骨近端骨密度无显著差异(P＞0.05)；检测项目示神经切断组骨折处骨痂形成多，力学强度差，骨痂成熟度差(P＜0.05)，以感觉神经（后根）切断组尤甚(P＜0.05)［结论］感觉神经纤维对骨折愈合的影响较运动神经纤维显著；完整的神经支配是正常骨折愈合的必要条件。
【关键词】 感觉神经； 运动神经； 脊神经根切断； 骨折愈合
Experimental evaluation of the fracture healing of rats following sensory nerve/motor nerve radicotomy∥ WANG Xiao-jian，SU Yun-xing，YU Jian-ping,et al. Department of Orthopaedics，Shanxi Provincial People's Hospital， Taiyuan 030012,China
Abstract：［Objective］To observe and analyze the effect of selective radicotomy on the fracture healing by selective nerve root rhizotomy.
［Method］Ninety rats were divided into three groups randomly, incluing the sham operate group (SO),the anterior rhizotomy group(ART) and the posterior rhizotomy group（PRT）. All rats were made experimental tibial transverse fracture at nerve-cut side and the fracture was fixed with intramedullar nail.In coordination with the fracture-tibia side，the rats were made with selective radicotomy from L4 to L6. Animals were sacrified after 30 days and tension-test of every pair tibia was recorded by Instron5050 electrical univerials tester to evaluate the mechanical properties of bony callus. The BMD was measured in proximal end of every fracture-tibia and the size of bony callus was evaluated by wet weight and radiograph. The callus property was monitored by histological assessment.All data of fracture side were divided by uninjured-side to get the ratio for evaluation for every pair of tibia.
［Result］There was no statistical significance about the BMD of the fracture-tibia between the SO group and the other groups(P＞0.05).The data of wet weight and radiograph of fracture-tibia showed an increased callus formation, but result of tension-test indicated strength of bony callus were decreased and weaker in all denerved groups(P＜0.05) and more marked in PRT group(P＜0.05).
［Conclusion］The sensory nerve could show more important role than the motor nerve during the bone fracture healing and normal innervation is essential while nerve injury could make the callus large,but mechanically insufficient.
Key words：sensory nerve； motor nerve； radicotomy； fracture healing
骨折愈合是一个复杂的生物学过程，受诸多因素的影响。随着研究的不断深入与发展，众多学者逐渐意识到周围神经系统在骨代谢，特别是骨折的修复、重建中具有重要作用。其主要是通过肽能神经分泌的神经肽对骨组织起作用的。含神经肽的神经称为肽能神经，肽能神经在骨组织中广泛分布。各种研究的方法也就是通过选用不同途径选择性的阻断神经肽对骨组织的作用而实施的。本实验通过选择性切断感觉、运动神经，来观察不同性质神经损伤后骨折愈合的情况，并进一步探讨不同性质神经纤维对骨组织的生理作用。由于胫骨的神经纤维主要来源于坐骨神经，而坐骨神经主要由L4～6神经根组成，故本实验采取大鼠一侧L4～6神经根选择性切断与同侧胫骨骨折的动物模型为实验组；对照组采取只暴露一侧L4～6神经根与同侧胫骨骨折的动物模型。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
1.1.1 大鼠的选择 选用6个月龄、未孕产、雌性大鼠作为实验动物；
1.1.2 动物分组 Wistar大鼠90只（山西医科大学动物中心提供），体重（200±15）g，随机分成3组,每组30只。
(1)对照组(The sham operated group，SO组)；
(2)前根切断组（The anterior rhizotomy group，ART组）；
(3)后根切断组（The posterior rhizotomy group， PRT组）。
1.2 手术操作技术路线
1.2.1 麻醉 经腹腔注射10%水合氯醛麻醉,剂量0.4 ml/100 g，大鼠仰卧位固定。
1.2.2 寻找颈外静脉，建立补液途径（图1-2）：通过预实验得知，手术操作过程中失血量如多于5 ml，易引起大鼠失血过多而休克死亡，本实验补液途径选择颈外静脉，优点为补液快捷与补液确实，术后节扎不影响血液回流。在一侧锁骨中点上约0.8 cm处，可较顺利暴露出颈外静脉，分离，用在手术过程中逐渐补入含林格液、止血敏、青霉素、安定、生理盐水等混合液体约5 ml。
1.2.3 暴露或切断一侧L4～6神经根：大鼠坐骨神经由L4～6脊神经根组成（图3）。其椎管直径在腰段平均只有约2 mm,开椎管时要仔细，避免损伤马尾。大鼠俯卧位固定，以髂嵴平对L６椎棘突定位（图4），于背部作后正中L3～S2纵切口，依次切开软组织，暴露椎板,使用上颈椎咬骨钳咬除关节突与部分椎板。SO组大鼠暴露一侧L4～6神经根；ART组大鼠在手术显微镜4倍视野下用显微器械选择性切断一侧L4～6前根；PRT组于脊神经节节后选择性切断一侧L4～6后根。
在开椎管过程中，使用一把蚊式钳向上提拉L3棘突，尽量使马尾神经远离椎管后壁，另一手置上颈椎咬骨钳于大鼠脊柱纵轴平行位、卡于L4～5关节突中点偏上部，向上钳咬，一般可顺利暴露硬膜，不造成马尾的损伤。手术操作中建议不使用电刀，使用无菌敷料压迫止血，笔者在实践中发现使用电刀易造成大鼠背部肌肉的大面积坏死。另外在开椎管时，建议首先在L4～5关节突处操作，此处大鼠椎管直径较宽，而且脊髓、马尾组织距椎管后壁较远。首先暴露L4神经根后可以在直视下根据椎板的厚度来暴露L5、6神经根（图5）。在暴露L6神经根时应注意其向腹侧偏移较多，操作时应注意，否则易造成大出血导致大鼠死亡。
1.2.4 髓钉打入操作 直视下沿神经切断侧胫骨嵴切开，在胫骨斜坡处打入d=1 mm克氏针。由于大鼠胫骨呈不规则弯曲，因此需要合适的入针角度才可顺利打入克氏针。笔者在实践中采用“以长度检测角度”的原则，打入长度约20 mm～25 mm，位置都基本良好，固定牢固，打入过长易将胫骨打断，过短易导致克氏针随大鼠术后活动脱出。
1.2.5 胫骨骨折操作 打入克氏针后，在距胫骨粗隆约5 mm处用弯剪剪断胫骨，造成横行骨折。由于胫骨中段以皮质骨为主，如在此处操作，易造成粉碎骨折，所以采取于大鼠胫骨中上段松质骨较多处手术操作。
1.2.6 闭合颈部补液伤口，术后单独饲养，连续肌注青霉素3 d，1周后各组合笼饲养。
1.2.7 术后3 d检验选择性脊神经根损伤的手术效果 提住鼠尾，使用卵圆钳钳夹大鼠患肢远端，大鼠有鸣叫反射而患肢不收缩者为感觉神经完好，运动神经受损；钳夹无鸣叫反射、患肢却有运动者为感觉神经损伤而运动神经完好。
1.2.8 取材 术后30 d采取所有大鼠患侧及健侧胫骨标本，在操作中注意保留骨膜，以免破坏骨痂。排除不符合实验要求的胫骨，共得到胫骨标本：SO组28对，ART组25对 ，PRT组24对。
1.3 观测项目
1.3.1 所有大鼠处死后均用天平进行体重秤量。
1.3.2 拍双侧胫骨侧位X线片 用自制的照相模板固定大鼠双下肢，拍双侧胫骨侧位像（X线机型号：SIEMENS FD-X, 山西省人民医院放射科提供）。使用游标卡尺（精确度0.02 mm）在X线片上测量患侧骨痂宽度及健侧胫骨相应位置的皮质宽度。患侧骨痂最大直径处记为A，健侧相应皮质部位宽度记为B，以A/B的比值做数据统计分析。
1.3.3 取出所有大鼠健侧及患侧胫骨行湿重称量（AB 104-N型电子秤，精确度0.1 mg，山西医科大学公卫教研室提供），用患侧胫骨数据除以同一大鼠健侧数据，得到一相对数。
1.3.4 于患侧胫骨近端行骨密度分析（DPX-L型双能X线骨密度测量仪，山西省儿童医院提供）。
1.3.5 每组分出约1/3患侧胫骨做骨痂组织学切片观察 包括骨痂中类骨质、骨小梁等项目的大体形成、分布情况。
1.3.6 每组剩余胫骨（SO组20对，ART组18对，PRT组17对）两端用Ⅱ型造牙树脂制成力学测试辅具，以Instron5050万能材料试验机（太原理工大学生物力学教研室提供）进行拉伸力学测试，得出最大载荷数据。以患侧最大载荷/健侧最大载荷，得到一相对数。
在用Ⅱ型造牙树脂制成力学测试辅具过程中，笔者采用2 ml医用一次性注射器为原料，经加工成为树脂塑形模具。这种模具不仅可以提高制作速度，而且可以使胫骨两端树脂辅具保持较高的同轴度，减少拉伸测试时对胫骨的横向剪切力（图6）；
1.3.7 软件SPSS 10.0统计数据，每项内容均行多样本方差齐性检验（Levene检验，α=0.10水准），多样本均数LSD-t检验（α=0.05水准），内容包括：
①大鼠的处死前体重数据；
②大鼠患侧胫骨近端骨密度数据；
③胫骨影像学资料相对数数据；
④胫骨湿重相对数数据；
⑤胫骨最大载荷相对数数据；
2 结 果
2.1 术后30 d影像学资料示
SO组骨折愈合良好、骨折线已消失，ART组、PRT组骨折线明显，骨痂体积大、数量多，PRT组尤甚（图7）。
2.2 组织学切片示
SO组骨痂骨小梁排列紧密、呈板层状，细胞数量少，类骨质沉积多，见到较多成骨、破骨细胞进行骨改建，整体处于骨性骨痂改建期；ART组骨痂骨小梁排列紧密度较SO组稀疏，类骨质较多，细胞种类较SO组多；PRT组骨痂骨小梁排列较ART组更加稀疏，类骨质较少，细胞种类较多，整体处于纤维骨痂期（图8-10）。
2.3 3组大鼠处死后体重、患侧胫骨近端骨密度数据方差齐（Levene统计量＞0.10），结果示组间无显著性差异（P＞0.05）（表1、表3）。
2.4 相对数资料数据统计结果(表2、3)
2.4.1 影像学资料 SO组与ART组、PRT组均有统计学意义（Ｐ＜0.05），ART组与PRT组间有统计学意义（Ｐ＜0.05）。
2.4.2 胫骨湿重数据 SO组与ART组、PRT组均有统计学意义（Ｐ＜0.05），ART组与PRT组间有统计学意义（Ｐ＜0.05）。表1 大鼠处死前体重、患侧胫骨近端骨密度表2 相对数数据表3 数据统计结果
2.4.3 拉伸最大载荷 SO组与ART组、PRT组均有统计学意义（Ｐ＜0.05），ART组与PRT组间有统计学意义（Ｐ＜0.05）。
3 讨 论
3.1 周围神经系统对骨组织作用的理论基础
周围神经通过释放神经肽直接或间接作用于成骨细胞或破骨细胞而对骨组织起作用［1］。在体循环中,神经肽的含量非常低,与其起到生理作用所需的浓度相差甚远,所以神经肽主要是在局部通过旁分泌而起作用的。
近年来，通过免疫组化技术应用于骨组织，已发现骨组织中含有降钙素基因相关肽(CGRP)、P物质(SP)、血管活性肠肽(VIP)、神经肽Y (NPY)、腺苷酸环化酶激活肽(ACAP)等众多神经肽［2，3］。CGRP等众多已发现的神经肽现已发现主要有2个来源：(1)脊髓后角细胞；(2)来源于脊神经节细胞（DRG）。近年来解剖学和生理学研究表明脊神经节是机体内外环境与脊髓中枢联接的纽带,是多种神经肽制造场所和输送站。现已知脊神经节中CGRP最丰富，且已证实与骨折愈合密切相关［4］，但目前国内外还未有关于脊神经节对骨折愈合影响的报道。
周围神经对骨组织的作用主要是通过肽能神经分泌的神经肽对其起作用，各种研究的方法也就是通过选用不同途径选择性的阻断神经肽对骨组织的作用而实施的。
3.2 失神经骨折愈合的结果
实验结果示失神经骨折愈合可导致骨痂生成量明显增多，但力学强度反而减少。造成这种现象的原因目前主要有以下观点：
3.2.1 神经肽对骨生长的调节作用减弱 不同的神经肽对骨细胞起不同的调节作用。如CGRP能促进成骨细胞中环磷酸腺苷(cAMP)形成［5］,从而提高成骨活性,并可刺激骨髓干细胞有丝分裂和骨基质细胞的分化。失神经后,这种调节作用丧失或减弱,以至于骨折愈合过程发生了改变,骨痂强度较差,正常骨折的愈合受到影响。
3.2.2 神经肽对血流量调节作用减弱 骨折的愈合需要丰富的血流,各种肽能神经主要分布于血管周围,参与血管功能的调节。CGRP、VIP、SP均有明显的扩血管作用。CGRP是至今已知的最强的血管扩张剂之一［6］,其强烈的扩血管作用主要是通过直接作用于血管平滑肌而实现的,部分通过内皮途径起作用。CGRP还具有刺激血管内皮细胞增生的作用,从而可促进血管的长入,增加局部血流,是正常骨折愈合所必不可少的。
3.2.3 神经损伤后骨折局部微动增加 CGRP和SP可作为C类、Aδ类神经纤维递质传导痛觉,防止骨折端过度活动。神经切断后,骨折局部保护性痛觉传递消失，骨折端微动增加,这种微动可能是形成大量骨痂的原因之一,但不是主要原因。
图1 颈外静脉的解剖分离 图2 术中颈外静脉补液 图3 坐骨神经解剖组成 图4 大鼠脊柱定位
图5 L4～6神经根暴露 图6 两端用Ⅱ型造牙树脂包埋的胫骨 图7 术后30 d影像学资料比较 图7a.SO组 图7b.ART组 图7c.PRT组
图8 SO组骨痂 HE×100 图9 ART组骨痂 HE×100 图10 PRT组骨痂 HE×100
3.2.4 失神经后骨折肢体不能负重,骨痂不能按肢体负重应力进行适应性重建,骨小梁不能按力线合理排列,均可造成骨痂力学强度减弱［7，8］。所以，骨痂虽然是骨折愈合所必需的，但骨折愈合的快慢不在于骨痂体积与范围的大小，而骨痂质量才是骨痂成熟的体现。
3.3 骨密度统计结果分析
有研究表明［9］：神经损伤后，骨密度的改变以胫骨近端最快、程度最重。实验数据显示，术后4周，各组大鼠患侧胫骨近端的骨密度仍无显著性差别，这就减少了胫骨整体密度降低、力学强度降低对局部骨痂的影响，使各组骨痂力学强度间具有了可比性。
3.4 感觉神经损伤对骨折愈合的影响
已有研究证实［2，3］神经肽CGRP、SP和ACAP主要存在于感觉神经中，NPY和VIP主要存在于交感神经中，其中，以CGRP肽能神经分布最广，主要分布于骨组织中生长活跃的部位。已有研究证实CGRP与骨折愈合密切相关［5］，感觉神经的损伤，阻断了CGRP对骨组织的主要作用途径。
本实验中感觉神经切断的PRT组形成的骨痂体积更大，数量更多，但力学强度更差。这与上述理论相符。
3.5 运动神经损伤对骨折愈合的影响
运动神经损伤后，患肢不能负重，减少了应力对骨痂塑形的作用。骨痂中骨小梁排列紊乱，钙质沉积少。国内有文献报道［10］，应用选择性损伤脊神经前/后根研究骨代谢，并认为单纯运动神经损伤主要改变骨基质中的无机盐成分，单纯感觉神经损伤主要在骨基质中的胶原成分。
3.6 临床意义
3.6.1 临床中所见的骨折伴神经系统损伤的病例，其骨折端所形成的是体积大、数量多、力学强度差的病理性骨痂。
3.6.2 评测单纯运动神经或感觉神经损伤患者肢体骨量的变化。
临床上单纯运动神经功能障碍及单纯感觉神经功能障碍所致的疾病并不少见,如脊髓灰质炎后遗症、重症肌无力、原发性侧索硬化症、肌营养不良等都是典型的运动神经(元)功能障碍性疾病。又如脊髓空洞症、格林巴利综合症、遗传性感觉性神经病等是非常具有代表性的感觉神经功能障碍性疾病。
3.6.3 为临床神经肽制剂的应用提供一定的理论实验基础。
3.6.4 为神经系统与骨折愈合关系的研究提供一定的实验基础。
3.7 数据统计方法的讨论
骨痂的影像学资料也是常用来评测的项目，评测的方法主要是目测盲评。本实验以所得X线片资料均进行量化处理：用游标卡尺测量患侧骨痂最大宽度处数据，健侧相应水平胫骨宽度数据，相除得到的相对数数据进行统计。笔者认为使用相对数进行统计分析，主要有2个优点：(1)在大鼠胫骨横型骨折手术操作中，尽管术者有一个大概的定位，如中上段、中段、距胫骨结节一定距离处等等，但是在实际操作中，难免有偏差。由于大鼠胫骨是不规则体，所以不同节段的横径是不一致的，可比性就差。(2)大鼠的个体差异会影响结果，尽管各组内大鼠体重相近，但仍可能是两组间某些大鼠胫骨的一些个体差异引起的。使用相对数数据统计，可以进一步消除以上因素、甚至是另外许多没有被预见的大鼠胫骨本身的个体因素对本实验的影响。在骨折愈合影像学资料分析中，应用相对数量化数据较应用绝对数量化数据进行统计更能有效消除个体差异，得到更加客观的结论。
骨痂的生物力学强度是骨折愈合实验中常用来评测的项目。但在许多研究中，所采用的大多是以患侧胫骨的最大载荷数据为结果进行统计分析的。笔者认为：由于某些大鼠胫骨的一些个体差异引起的，诸如术后骨组织生长速度不一，大鼠运动量的不同导致骨痂的力学塑形不同步，或某些胫骨的局部皮质壁厚，力学结构更有利于承受载荷等因素，会导致大鼠的胫骨失去可比性。本实验以患侧/健侧最大载荷的相对数数据进行统计分析。其意义在于，可以最大限度的消除大鼠胫骨间的个体差异对力学载荷的影响，得到更加客观的结论。
总之，骨折愈合是一个极其复杂的过程，神经因素对于其有着重要的作用。失神经的骨折愈合会产生数量较多的有缺陷的骨痂，正常的神经支配是骨折愈合的必要条件，感觉神经对骨愈合的影响作用较运动神经显著。
【参考文献】
［1］ Togari A,Arai M,Mizutani S,et al.Expression of mRNAs for neuropeptide receptors and beta-adrenergic receptors in human osteoblasts and human osteogenicsarcoma cells［J］.Neurosci Lett,1997,233:125-128.
［2］ Ransjo M,Lie A,Mukohyama H,et al.Microisolated mouse osteoclasts express VIP and PACAP receptors［J］.Biochem Biophys Res Connun,2000,274:400-404.
［3］ Sisask G, Bjurholm A, Ahmed M, et al. The development of autonomic innervation in bone and joints of the rat［J］. J Auton Nerv Syst,1996,59:217-220.
［4］ 周 跃,刘正津,梅芳瑞.脊神经根和脊神经节的解剖与损伤［J］.颈腰痛杂志，1998，4：311-314.
［5］ 夏 群，苗军，张继东,等.神经系统对骨折愈合的调节［J］. 中华创伤杂志，2001；9，572-574.
［6］ 初同伟，王正国，朱佩芳，等. 骨折愈合过程中血管内皮生长因子及其受体的表达［J］.中华创伤杂志. 2001,6:344-346.
［7］ 秦 煜，裴国献. 神经因素对骨发生和形成的作用［J］. 中华骨科杂志，2002，2：118-120.
［8］ 马 昕，黄钢勇，姜建元，等. 不同神经损伤对骨折前期愈合影响的实验研究［J］. 中国矫形外科杂志, 2005，13-10:761-764.
［9］ 张宏志，张伯勋，刘郑生. 神经损伤与制动后骨密度的变化［J］. 中华创伤杂志,1999，5：369.
［10］朱建平，张伯勋，刘郑生，等. 选择性神经根损伤对大鼠骨代谢影响的实验研究［J］. 中国矫形外科杂志,2002，9-4：354-358.
作者单位：山西省人民医院骨科, 太原 030012