关节内注射医用臭氧对大鼠膝退行性关节炎的影响△

【摘要】  观察医用臭氧膝关节腔内注射对大鼠退行性关节炎的影响，探讨不同浓度医用臭氧对退行性关节炎的防治效应及可能机理。［方法］将SD大鼠40只随机分为A（正常对照组）、B(模型组)、C（空气组）、D（35 μg/ml医用臭氧组）、E（70 μg/ml医用臭氧组）5组，后4组复制出膝退行性关节炎（OA）模型， D、E组依据浓度不同，隔日1次给予膝关节腔内注射医用臭氧，每次1 ml，间隔一周再注射，共2周。4周后处死动物，HE染色观察光镜下关节软骨的一般形态、Masson染色进行软骨Mankin’s评分，关节灌洗液超氧化物岐化酶（SOD）、丙二醛（MDA）作为检测指标。［结果］B组光镜下关节软骨退变明显，Masson染色可见蓝绿色丢失较重，SOD下降，MDA升高；D组显微镜下关节软骨形态观察有明显改善， Mankin’s评分较A组无显著性差异，与B、C组比较有显著性差异（P＜0.05），SOD升高，MDA下降；E组显微镜下及Mankin’s评分较B组无明显改善，SOD下降，MDA升高。［结论］浓度为35 μg/ml医用臭氧组能够减轻退行性关节炎软骨退变，增强机体清除自由基的能力，从而有效防治退行性关节炎，而浓度为70 μg/ml医用臭氧组引起组织细胞脂质过氧化反应，导致关节软骨组织结构破坏。

【关键词】  臭氧 退行性膝关节炎 关节软骨 超氧化物岐化酶 丙二醛

  Effect of intra-articular ozone injection on degenerative cartilage of the rat’s knee∥YU Bin，ZHU Quan， HU Yan-jun，et al.Depantment of Traumatic Orthopedics,Nanfang Hospital,Nanfang Medical University，Guangzhou, 510515，China

    Abstract: ［Objective］To observe the effect of medical ozone on cartilage in the model of osteoarthritis (OA) to explore its therapeutic mechanism. ［Method］ Forty healthy adult SD rats were randomly divided into five groups :A（group normal）、B（group model）、C( group air), D(group O2～O3 35 μg/ml) and E(group O2～O3 70 μg/ml)（n=8 in each group）.The OA model was duplicated by performed anterior eruciate ligament transection（ACLT）and partial meniscectomy of 1/3 inside. Air was injected into joints of group C, according to concentration different,which O2～O3 35 μg/ml and O2～O3 70 μg/ml were respectively injected into joints to D and E group every other day ,every time 1～1.5 ml ,and after a week injected again. After the model was successfully made,the condylar cartilage of femur was excised after 4 weeks for the observation by transmissive microscope of HE staining. Mankin’s index was recorded.At the end of the experiment,douche fluid of the diseased joints were obtained for the measurements of superoxide dismutase（SOD）and malondialdehyde（MDA）. ［Result］The OA model in B group founded obviously degenerative changes under microscopy, resulting in mostly blue and green color destaining of Masson staining at superficial cartilage.The activity of SOD in the douche fluid of the diseased joints degraded and the quantity of MDA in the serum in the OA model group increased. The Mankin’s index in the group D was significantly higher than that in the group B、 C (P＜ 0. 05)，which had no significant differences between group A，and obvious improvement were found in group D under microscopy, SOD levels increased and MDA levels degraded.There was no significant differences to group B in the Mankin’s index. SOD levels degraded and MDA levels increased. ［Conclusion］Thirty-five μg/ml O3 can prevent degeneration of articular cartilage,improve the ability to clear free radical .There is reasonable effect for the treatment of OA,but 70 μg/ml O3 resultes peroxidatic reaction tissue and cell, which resultes to destroy of articular cartilage.

    Key words：ozone；  degenerative arthritis；  joint cartilage；  SOD；  MDA

    膝退行性关节炎（OA）是一种关节的慢性退行性病变，其主要的病理改变是关节软骨的降解［1］。近年来，随着臭氧（O3）广泛应用［2］，临床上有学者将O3关节腔内注射的方法用于治疗膝退行性关节炎，取得了较好的效果。为进一步了解O3对骨关节炎产生何种治疗作用，在前期临床试验的基础上，应用大鼠OA模型，膝关节腔内注射医用臭氧观察不同浓度医用臭氧对模型大鼠软骨显微镜下结构的影响。通过测定大鼠关节灌洗液SOD活力和MDA含量，探讨医用臭氧治疗退行性关节炎的可能机理，为临床运用提供依据。

    1  材料与方法

    1.1材料

    1.1.1  实验动物

    SPF级SD大鼠40只，体重160～220 g，复合饲料喂养（由南方医科大学实验动物中心提供，动物证书：2006B023）

    1.1.2  实验试剂

    超氧化物岐化酶（SOD）和丙二醛（MDA）测定试剂盒（由南京建成生物工程研究所提供），医用臭氧发生器（CHY-B型 中国山东淄博悦华医疗器械有限公司制造）。

    1.1.3  实验仪器

    Olympus光学显微镜，组织切片分析系统，550 nm分光光度计，37 ℃恒温水浴锅、台式离心机。

    1.2  实验方法与取材

    1.2.1  模型制备

    将实验动物［3］氯胺酮2 ml麻醉后，用剃须刀片将手术区域周围毛剃净，用湿纱布洗干净，碘伏消毒，常规铺巾。在靠近内侧切开皮肤及关节腔，将髌骨向后向外翻。并将膝关节处于最大的屈曲状态，暴露关节腔，用显微器械分离内侧半月板，用显微剪将内侧1/3的半月板切除，并剪断前交叉韧带，小心操作以防损伤软骨，生理盐水冲洗关节腔后，用3-0的细线缝合关节囊和皮肤，用碘伏棉球擦洗伤口，并贴上注射用敷帖。术前、术中均给予丁胺卡那1/3支肌肉注射，放入笼中饲养，任其自由活动，密切注意伤口感染以及其他并发症。模型组用显微器械作前交叉韧带切断加内侧1/3半月板切除术，不给予其他特殊处理。

    1.2.2  动物分组方法

    40只SPF级SD大鼠随机分为：A组（正常对照组）、B组(模型组)、C组（空气组）、D组（医用臭氧35 μg/ml组）、E组（医用臭氧70 μg/ml组）每组8只。B、C、D、E组分别进行造模，造模完成后， D、E组隔日1次给予膝关节内注射医用臭氧，每次1 ml，间隔一周再注射。D组：O3浓度35 μg/ml；E组：O3浓度70 μg/ml，空气组：膝关节腔内注射空气；每次1 ml，间隔一周再注射；4周后处死动物。

    1.2.3标本取材方法

    4周后，将大鼠麻醉固定于手术台上，切开皮肤及皮下组织，暴露关节囊，注意不要打开关节囊。从髌骨上囊部位注射入关节腔200 ul无菌的PBS，反复活动关节后，仔细抽取灌洗液，必要时切小切口吸取，灌洗液置-20 ℃保存备用。将动物麻醉用断颈法处死，迅速切取处死后大鼠的实验侧股骨内髁、胫骨平台关节软骨，修成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小组织块，软骨标本用4%多聚甲醛固定，15%乙二胺四乙酸（EDA）脱钙2周，石蜡包埋，HE染色，观察软骨形态学的变化。

    1.2.4  光镜观察（图1～12）

    将软骨组织进行Masson染色，在光镜下以Mankin’s评分标准进行评分，观察软骨组织结构、软骨细胞数量，Masson着色深浅和潮线的完整性，评分越高说明软骨损伤越重。HE染色观察病理形态。

    1.2.5  关节灌洗液检测SOD和MDA表达情况

    每份关节灌洗液稀释后，分别采用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物岐化酶（SOD）、采用硫代巴比妥酸法（TBA法）测定分析丙二醛（MDA）。应用南京建成生物有限公司提供的试剂盒，根据试剂盒提供的说明书进行操作。

    1.2.6统计学处理

    用SPSS10.0软件进行统计学处理，各组实验动物所有参数均数±标准差表示，组间采用方差分析，显著性t检验。

2  结果

    2.1关节软骨HE染色光镜下观察：

    2.1.1正常对照组

    软骨面规则，结构正常，无裂隙，细胞排列整齐；滑动层、过渡带、放射带、钙化层，四层清晰，潮标明显，无炎性细胞浸润。Masson染色正常软骨胶呈蓝绿色，钙化软骨及骨小梁胶原呈红色。

    2.1.2模型组及空气组

    关节软骨细胞排列不规则，软骨表面粗糙，有裂隙，可达深钙化层，裂隙周围可见脱水固缩坏死的软骨细胞。软骨基质溶解，潮标不完整，软骨细胞增生。Masson染色可见蓝绿色丢失较重，从潮标向上有许多呈火焰状向上升起的红染物，其着色同钙化软骨。

    2.1.335 μg/ml医用臭氧组

    软骨表面较规则，裂隙及纤维成分均较模型组及空气组少，可见少量软骨细胞增生。潮标基本完整，Masson染色见蓝绿色丢失减少。

    2.1.470 μg/ml医用臭氧组

    关节软骨细胞排列不规则，软骨表面粗糙，裂隙较浅，潮标不完整。Masson染色可见蓝绿色丢失较重。

    2.2膝关节软骨组织评分

    2.2.1正常对照组Mankin’s标准评分为0.0±0.0，模型组、空气组评分明显高于正常对照组（P＜0.01），D（35 μg/ml组）组评分低于模型组（P＜0.05），E（70 μg/ml组）组评分与B组（空气组）相比无明显差别（P＜0.05）。见表1。表1  各组动物的Mankin’s评分（x-±s） 例数Mankin’s评分正常组80±0模型组87.3±0.0△空气组87.1±0.0△△35 μg/ml组84.6±0.0*△70 μg/ml组87.8±0.0△△    注：模型组、空气组、70 μg/ml医用臭氧组与正常组比较△P＜0.05、△△P＜0.01，35 μg/ml医用臭氧组与模型组、空气组、70 μg/ml医用臭氧组比较*P ＜0.05、*△P＜0.01。

    2.3膝关节液SOD和MDA含量测定：

    2.3.1SOD含量测定

    关节液SOD含量，模型组、空气组、臭氧浓度70 μg/ml组较正常对照组明显降低，有显著性差异(P＜0.05、P＜ 0.01)；臭氧浓度35 μg/ml组SOD含量与正常组比较无显著性差异(P＞0.05)，而与模型组比较均明显升高，有显著性差异(P＜0.05 )，提示造模使实验大鼠自由基清除能力明显下降，符合骨性关节炎病理变化，支持造模成功。而关节内注射35 μg/ml臭氧组后可提高关节液SOD含量，促进氧自由基清除能力，随着臭氧浓度升高， 70 μg/ml臭氧组关节液中SOD反而降低，不能有效清除氧自由基。

    2.3.2MDA含量测定

    关节液MDA含量，模型组、空气组、70 μg/ml臭氧组与正常组比较明显升高，有显著性差异(P＜0.01)； 35 μg/ml臭氧组MDA含量与正常组比较无显著性差异(P＞0.05)，而与模型组比较均明显降低，有显著性差异(P＜0.01)，且35 μg/ml组MDA含量降低较空气组明显，有显著性差异(P＜0.05)。提示动物造模4周后关节液MDA含量显著升高，说明氧自由基攻击导致模型组MDA浓度升高，35 μg/ml浓度臭氧可降低关节液MDA含量，但随着臭氧浓度进一步升高并不能继续降低MDA含量，不能有效的清除氧自由基。结果见表2。表2  各组动物关节液SOD、MDA含量测定结果比较（x-±s）例数关节液SOD（NU/mgprot）关节液MDA（nmol/L）正常组827.61±4.052.4±0.5模型组816.42±3.02△△4.9±1.2△△空气组818.47±4.31△△4.6±1.3△△35 μg/ml组826.23±3.86*△2.5±0.7*△70 μg/ml组817.25±3.42△△4.8±0.9△△    注：模型组、空气组、70 μg/ml医用臭氧组与正常组比较△P＜0.05、△△P＜0.01，35 μg/ml医用臭氧组与模型组、空气组、70 μg/ml医用臭氧组比较*P ＜0.05、*△P＜0.01。  图1正常组 HE染色×100  图2正常组 HE染色×200  图3正常组Masson染色×100  图4正常组Masson染色×200  图5模型组HE染色×200  图6Masson染色模型组×200  图7空气组 HE染色×200  图8Masson染色空气组×200  图970 μg/ml组 HE染色×200  图1070 μg/ml组 Masson染色×200  图1135 μg/ml组 HE染色×200  图1235 μg/ml组 Masson染色×2002.3.3大鼠膝关节灌洗液SOD、MDA检测：

    3讨论

    3.1对OA认识及动物模型的建立

    退行性关节炎(osteoarthritis OA)是一种慢性、系统性疾病，好发于负重较大的膝关节、髋关节、脊柱等部位。OA以关节软骨的退行性变和继发性骨质增生为特点。目前国内外关于OA治疗主要集中在运动治疗、物理治疗、药物治疗等对症治疗，但效果不理想，对肌力、运动、关节稳定性及日常活动能力等均会产生较大影响。如何阻断OA恶性循环是许多研究者一直探讨的问题。本实验采用将前交叉韧带与部分半月板切除结合造模，破坏关节稳定性是目前国外常采用的一种OA造模方法。内侧半月板切除后，缓冲作用减少或消失，改变了关节的力学轴线，引起负重力线的内移，形成应力集中而继发骨小梁骨折、骨质塌陷［4］。切断前交叉韧带造成膝关节不稳，从而形成软骨退变的起始环节［5］。而医用臭氧膝关节内注射大鼠模型完全模拟临床情形，能够有效贴近临床，为防治退行性关节炎提供更加直接的实验依据。本实验操作简单、形成周期短、模型易于复制成功，与临床实际更相符，对照性强，适合于大鼠等好动的小动物，术后4周大鼠形成OA效果确切。

    本实验研究显示：35 μg/ml医用臭氧组光镜下关节软骨表面规则，裂隙及纤维成分较空气组少，可见软骨细胞增生；70 μg/ml医用臭氧组光镜下关节软骨表面极不规则，裂隙较多，软骨层纤维成分增多，说明35 μg/ml医用臭氧组使关节局部SOD含量升高，促进清除氧自由基的能力，从而达到防治效果。其机理可能为：一方面，减少软骨细胞凋亡，减轻DNA氧化性损伤［6］，维持软骨细胞膜结构和功能的完整性及软骨细胞的正常分裂增殖，促进软骨基质合成，抑制其分解；另一方面，抑制滑膜炎症，减少滑膜炎性物质释放［7］，阻断炎性滑液对软骨细胞、基质及滑膜的侵害，从而达到保护关节软骨，防治膝退行性关节炎的目的。有研究表明， 35 μg/ml医用臭氧主要发挥调节作用，70 μg/ml医用臭氧由于具有强氧化作用，可导致组织结构破坏［8］。OA患者关节、滑膜、滑液中常有中性粒细胞聚集，当其表面受到免疫复合物、补体成分等攻击，可释放大量的自由基，如超氧阴离子自由基［9］，很容易形成活泼的羟自由基引起关节软骨退变和关节滑液改变［10］。臭氧通过提高SOD含量［11］，促进清除氧自由基的能力，减轻氧自由基对关节软骨酶的损伤，中和氧化产物、拮抗炎症介质、减轻膝关节滑膜及周围组织炎症［12］。臭氧通过改善膝关节腔内环境，打断关节软骨损伤的恶性循环，促进关节软骨修复再生，延缓关节退行速度，说明浓度为35 μg/ml医用臭氧用于治疗OA患者是适宜的。而70 μg/ml医用臭氧由于浓度过高，高浓度臭氧气体可能损伤蛋白和DNA，诱发细胞坏死和调亡，影响软骨细胞及基质的增殖能力，而不适宜治疗OA患者。

    本实验初步观察了不同浓度医用臭氧对大鼠退行性关节炎的关节软骨结构变化及氧自由基的影响。如果要进行更为全面的观察，尚需研究骨性关节炎生化指标的变化及远期临床疗效的评价，同时还需更加深入的进行作用机理方面的研究。

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作者单位：南方医科大学南方医院a.创伤骨科；b.介入治疗科，广州 510515