不同营养因子组合对大鼠脊髓神经元的作用研究

【摘要】  探讨NGF、bFGF和BDNF的不同组合对大鼠脊髓神经元的作用。［方法］利用神经元培养技术，将新生1 d的SD大鼠脊髓神经元接种于培养板，根据不同因子两两组合分为3个实验组、空白对照组和单因子对照组，因子终浓度均为50 ng/ml。倒置相差显微镜动态观察，接种后第3、7 d细胞爬片行βtubulin3免疫荧光染色和Hoechst染色。测量阳性细胞最长突起长度，计算阳性细胞率，第1、3、5、7、9 d行MTT检查，以OD值绘制生长曲线。［结果］各实验组神经元突起长度均优于对照组（P<0.05），联合应用组优于单因子组，其中以A组（BDNF+bFGF）突起最长，各实验组βtubulin3阳性细胞率均高于对照组，MTT结果与染色结果一致。［结论］特定浓度下NGF、bFGF及BDNF可以有效促进大鼠脊髓神经元轴突的生长，并可有效维持神经元细胞存活，联合应用作用增强，BDNF+bFGF作用最强。

【关键词】  神经营养因子 脊髓 神经元 轴突 细胞培养

    Combined effects of different neurotrophins on rat spinal cord neurons∥XIAO Wei, LUO Zhuojing, HUANG Ming, et al. Department of Orthopaedics, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China

    Abstract：［Objective］ To investigate the combined effects of different neurotrophin couples of NGF, bFGF, BDNF on rat spinal cord neurons.［Method］Spinal cord neurons were obtained from SD rats born within 1d, and then were seeded in culture plates. Different factors and their couples were added in each chamber while DMEM/F12 served as controls, concentration of NGF, bFGF or BDNF were 50ng/ml. Phase contrast microscope observation was done. At the 3rd and 7th day after incubation, the cells were detected by βtubulin3 immunofluorescence and Hoechst staining. The length of neuritis was measured，and the numbers of neuron cells and nuclears were determined. At the 1st, 3rd, 5th, 7th and 9th day MTT method was used, and the growth curve  was made according to OD results.［Result］ The length of axon and positive rate in the experimental groups were superior to those in the control group (P<0.05).The effects in the combined groups were superior to the single groups, especially in the group of BDNF+bFGF. MTT method produced the same results as staining.［Conclusion］ NGF, bFGF and BDNF can enhance rat spinal cord neuronal neurite outgrowth and survival. Combined use of any two can produce better results, especially for the combined use of BDNF and bFGF.

    Key words：neurotrophin;   spinal cord;   neuron;   neurite outgrowth;   cell culture

   　外周神经损伤后，损伤神经的修复与众多因素有关，其中相应节段脊髓神经元的存活与轴突再生非常关键。神经生长因子（nerve growth factor，NGF）作为最早发现也是研究最为全面的神经营养因子［1］，其促神经元生长与存活的功能是众所周知的［2］。碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）具有促进神经元生长、保护神经细胞、促进神经损伤修复的作用［3］。BDNF（brainderived neurotrophic factor，BDNF）也是神经营养因子家族中经典的一员，具有支持神经元存活与突起生长的作用。这3种因子既然都有较强的促神经元存活与生长的特性，那么联合应用对脊髓神经元的作用如何，哪种组合作用最强？为此作者设计了这个实验。

    1  材料与方法

    1.1  动物和材料

    　　新生1d SD大鼠由第四军医大学实验动物中心提供。DMEM/F12培养基、新生牛血清购自Gibco公司，FITC标记羊抗鼠IgG购自Boster公司，Hoechst33258染液购自碧云天生物技术研究所。NGF、bFGF、BDNF、βtubulin3抗体、阿糖胞苷、MTT、胰蛋白酶、多聚赖氨酸、台盼蓝购自Sigma公司。多聚甲醛、DHanks液、PBS等常用试剂均由西京医院全军骨科研究所提供。

    1.2  脊髓神经元培养

    　　将新生1 d的SD大鼠处死浸入75%酒精15 min，无菌预冷DHanks液冲洗2遍，俯卧置于盛有预冷DHanks液的大培养皿内，无菌条件下剪开背部皮肤，向两侧牵开，暴露脊柱。解剖显微镜下，自上而下划开椎管，向两侧轻轻牵开椎弓，暴露脊髓，一镊固定另一镊小心分离，取出完整脊髓，置于预冷DHanks液中。镜下尽量剥除脊髓表面的纤维血管膜，眼科剪将其制成约1 mm3的颗粒。0.25%胰蛋白酶37℃消化20 min，常规终止消化，1 000 r/min离心5 min弃上清，用含20%新生牛血清的DMEM/F12培养液重悬，吹打成单个细胞悬液，调整细胞浓度到5×105个/ml，台盼蓝染色计数活细胞数在95%以上，接种于置有圆盖玻片的24孔板（事先用25 mg/ml多聚赖氨酸包被），每孔加入细胞悬液100 μl。按不同因子组合分为NGF+bFGF组、NGF+BDNF组、bFGF+BDNF组和单纯培养液（空白对照）组，另设3个单因子对照组，各组因子终浓度均为50 ng/ml，每组设6孔。按上述分组及终浓度加入因子和含20%新生牛血清的DMEM/F12培养液，每孔液体总量500 μl。置于37℃、5%CO2的孵箱内培养。接种后第3 d半量换液，补充半量因子，加入5 μg/ml的阿糖胞苷，作用48 h后去除。以后每3 d半量换液并补充半量因子。倒置相差显微镜动态观察细胞生长情况。

    1.3   免疫荧光染色及阳性率计算

    　　接种后第3 、7d，从培养板内取出细胞爬片，行免疫荧光染色和Hoechst染色。一抗为βtubulin3（鼠抗，1∶1000），二抗为FITC标记IgG（羊抗鼠，1∶50）。爬片经PBS冲洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS振洗3遍，每次5 min。滴加一抗，湿盒内4℃过夜，次日晨去除一抗，PBS振洗3遍后滴加二抗，37℃保温1 h，PBS振洗2遍。滴加Hoechst33258染液，5 min后去除，PBS振洗2遍，吹干，50%缓冲甘油封片。荧光显微镜观察，绿色荧光为βtubulin3阳性细胞，蓝色荧光为细胞核。20倍镜下每组随机选取10个视野，采集照片，计数每个视野内阳性细胞数及细胞核数，取平均数，按此公式计算：阳性细胞率=βtubulin3阳性细胞数/细胞核数。

    1.4   神经元突起长度测量

    　　20倍镜下每组随机采集10张照片，应用ACT2U软件每组随机选100个细胞，测量其最长突起长度（胞体至突起末端长度），求平均值。

    1.5   MTT检测细胞活性及绘制生长曲线

    　　相同方法取得脊髓细胞，接种于包被过的96孔板，分组及因子浓度同上。接种后第1、3、5、7、9 d， MTT法检测细胞活性。每孔加入终浓度5 μg/ml的MTT，继续培养4 h后，每孔加入100 μmol的DMSO，振荡5 min待结晶完全溶解后，酶标仪测量吸光值，波长570 nm。重复测量10次，取平均值。根据OD值绘制生长曲线。

    1.6   统计学处理

    　　应用SPSS 13.0软件进行统计学处理，数据用±s处理，采用方差分析和SNKq检验分析每两组间显著性差异。

    2  结    果

    2.1  形态学观察

    　　细胞接种后，分散良好，细胞呈圆形，胞体饱满，折光性好。接种6 h后，开始有部分细胞贴壁呈圆形或椭圆形，并有少数细胞有细小突起长出。24 h后，细胞均已贴壁并长出突起，以双极和多极细胞为主，少部分细胞胞体大且轮廓不清，可能为胶质或雪旺细胞。48 h后，实验组细胞突起变长，其中有少部分突起相互连接，对照组突起长度较短小。72 h后，细胞间突起连接成网状，实验组细胞间连接较多，对照组仅有极少数细胞间出现连接。由于加入阿糖胞苷，死亡细胞数目在第4、5 d增多。去除阿糖胞苷作用后，细胞生长旺盛，相互间连接呈致密网状，7 d左右达高峰。第2周，细胞生长状态逐渐变差，细胞折光性不强，胞体欠饱满，并有部分细胞崩解死亡。第3周，细胞聚集成团，细胞突起变短，细胞间连接稀疏，大量细胞脱落，漂浮死亡（图1）。

    2.2  免疫荧光染色及阳性率

    　　荧光显微镜下，神经元细胞可被激发出绿色荧光，细胞核可被激发出蓝色荧光，计数神经元及细胞核数目后，求得阳性细胞率。计算结果显示，各实验组神经元存活率均高于对照组及单因子组，具体结果及阳性细胞率（表1）。 表1  第3、7 d βtubulin3阳性细胞率*阳性率优于对照组(P<0.05); **阳性率优于单因子组(P<0.05).

    2.3  细胞突起长度测量

    　　经免疫荧光染色后，神经元胞体及突起清晰可见，测量神经元最长突起长度，结果显示各实验组突起长度明显高于对照组（P<0.05）。BDNF+bFGF组优于其他联合应用组（P<0.05）（表2）。

    图1  第3、7 d神经元的光镜和βtubulin3免疫荧光染色照片（20×）  a、b.BDNF+bFGF group 3 d；c、d.Control group 3 d；e、f.BDNF+bFGF group 7 d；g、h.Control group 7 d

    2.4   MTT法绘制生长曲线

    　　MTT法检测完毕后，根据OD值绘制细胞生长曲线（图2）。曲线总体走行呈下降趋势。在1、3 d各组OD值相差不大，5、7、9 d实验组OD值明显高于对照组，但各实验组之间差别不明显。 表2  第3、7 d神经元最长突起长度比较*与单因子组比较(P<0.05); **与其他联合应用组比较(P<0.05).图2  根据OD值绘制的细胞生长曲线

    3  讨   论

    　　NGF、bFGF和BDNF对神经元作用非常广泛。体外研究多集中在某一因子的不同机制、通路及信号等方面，对于双因子的研究不是很多。本实验对双因子联合应用对神经元的作用进行了初步探讨。NGF主要通过细胞上的高亲和力TrkA受体发挥作用［4］；bFGF可以与其特异性受体结合，启动对再生轴突延长的直接促进作用［5］；BDNF同样具有支持神经元存活与突起生长的作用［6，7］，其高亲和力的TrkB受体是发挥作用的主要途径。不同神经营养因子通过其特异受体发挥作用，不同的受体所介导的生物学效应不同。联合应用各种因子，可能会通过同一细胞的不同的受体介导不同效应，其作用可以互补［8］。

    　　由新生大鼠脊髓组织取得的为神经元、胶质细胞、成纤维细胞及Schwann细胞的混合细胞。阿糖胞苷具有抑制非神经元生长的作用，因此纯化后神经元细胞的比例大大增加。由于神经元为终末分化细胞，在培养状态下不会分裂增殖，反而会由于培养环境等因素逐渐死亡，根据OD值绘制的生长曲线总体呈下降趋势可以解释这个问题。在第1 d时，细胞刚接种无明显生长，故OD值相差不明显。第3 d加入阿糖胞苷，非神经元细胞大量死亡，故3～5 d生长曲线有较大的下降趋势。去除阿糖胞苷作用后剩余细胞正常生长过程中伴有少量细胞死亡。实验结果证实了双因子联合应用可以促进脊髓神经元的存活。

    　　βtubulin3是微管蛋白的亚型，为神经元细胞及突起的特异性标记物，所以神经元细胞呈βtubulin3免疫组化阳性。Hoechst33258是直接对细胞核着色的蓝色荧光染料，所以蓝色细胞核代表全部的细胞数。存活细胞率可以用βtubulin3阳性细胞率反映，结果显示3种因子单独使用都有一定的保护神经元作用，可以保护神经元存活。联合应用的保护作用均优于单因子及对照组，说明此3种因子保护作用可叠加。但各联合组之间的差别不是很明显，此结果与MTT检测结果一致。

    　　不同的双因子组合作用于脊髓神经元后，突起长度各联合组优于单因子组（P<0.05），证明促突起生长方面双因子具有协同作用。而BDNF+bFGF组又优于其他联合应用组（P<0.05），提示BDNF和bFGF组合能更好促进脊髓神经元的突起生长，究其原因，实验所取的细胞中，前角运动神经元占很大比例，而BDNF对运动神经元突起生长的促进作用优于NGF，所以会产生上述的结果［9］。

    　　本实验是对双因子联合应用的初步探讨，证实了特定浓度下BDNF联合bFGF对脊髓神经元的良好生物学效果，为更好应用营养因子治疗神经损伤提供了理论依据。

【参考文献】
  ［1］ Aloe L, Rita Levi, Montalcini R. The discovery of nerve growth factor and modern neurobiology［J］ . Trends Cell Biol, 2004, 7: 395-399.

［2］ 郝雅斌, 王蓬文. NGF与细胞凋亡［J］. 国外医学·老年医学分册, 2003,2: 72-75.

［3］ Jungnickel J,Haase K,Konitzer J,et al. Faster nerve regeneration after sciatic nerve injury in mice overexpressing basic fibroblast growth factor［J］. J Neurobiol, 2006,9: 940-948.

［4］ Shao Y, Ma H, Wu Y, et al. Effects of nerve growth factor on changes of myelin basic protein and functional repair of peripheral nerve following sciatic nerve injury in rats［J］. Chin J Traumatol, 2002,4: 237-240.

［5］ Himmelseher S, Pfenninger E, Georgieff M. Effects of basic fibroblast growth factor on hippocampal neurons after axonal injury［J］. Trauma, 1997, 42: 659-664.

［6］ 刘京升, 孙正义, 董晓丽. 脑源性神经营养因子对大鼠坐骨神经损伤诱导神经元凋亡的作用［J］. 中华实验外科杂志, 2002,2: 130-131.

［7］ Alderson RF, Alterman AL, Barde YA , et al. Brain-derived neurotrophic factor increase survival and differentiated function of rat septal cholinergic neurons in culture［J］. Neuron, 1990, 5: 297-306.

［8］ 李 强, 李 民, 伍亚民. NGF与CNTF促周围神经再生作用的差异性及协同性研究进展［J］. 中国矫形外科杂志, 2004, 12: 537-539.

［9］ Kerekes N, Landry M, Lundmark K, et al. Effects of NGF, BDNF, bFGF, aFGF and cell density on NPY expression in cultured rat dorsal root ganglion neutones［J］. J Auton Nerv Syst, 2000,1-3: 128-138.

作者单位：第四军医大学西京医院 全军骨科研究所，西安市 710032