点击显示 收起
【摘要】 探讨大鼠脊髓损伤后伤段脊髓线粒体超微结构的改变和线粒体呼吸功能的变化。［方法］48只SD大鼠，随机分为：对照组（假手术组）和脊髓损伤组（SCI组），每组又分为处理后6、12、24 h三时相组，每组8只，采用Allen's打击法造成大鼠脊髓损伤模型，在各时相提取伤段脊髓线粒体，透射电镜观察线粒体超微结构的改变；Clark氧电极法测定线粒体呼吸功能，根据线粒体呼吸耗氧量换算出R3、R4、RCR、P/O比值。［结果］SCI组脊髓组织线粒体体积增大,嵴稍肿胀,嵴内腔扩大,部分线粒体出现膜结构不清、嵴紊乱,部分神经细胞内的高尔基器、内质网稍肿大。随着损伤后时间的延长，可见部分线粒体嵴断裂溶解、膜破裂和线粒体数量减少等。SCI组在伤后6 、12 h和24 h R3、RCR和P/O显著低于对照组，R4显著高于对照组，有极显著统计学意义（P<0.01）。［结论］大鼠脊髓损伤后线粒体的超微结构发生明显改变；伤段脊髓线粒体呼吸功能明显下降。
【关键词】 脊髓损伤 线粒体 超微结构
Changes of ultrastructures and respiratory function of the spinal cord mitochondrial in experimental spinal cord injury∥CAI Weihua, ZHANG Ning, JIA Lianshun,et al.Department of Orthopaedics , The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029,China
Abstract：［Objective］To study changes of ultrastructures and respiratory function of the spinal cord mitochondrial in experimental spinal cord injury.［Method］Forty-eight SCI models in adult SD rats were built based on modified Allen’s method. Mitochondria was extracted from injuried spinal cord tissue by using modified Estabrook’s method at 6h, 12h and 24h after SCI. Then ultrastructural changes and respiratory function, including R3,R4,RCR,P/O were observed.［Result］Ultrastructure of mitochondria was damaged greatly.The results revealed that R3、RCR and P/O of injuried spinal cord mitochondria decreased significantly after injury compared to the normal control group(P<0.01) at 6 h,12 h and 24 h after SCI, but R4 increased evidently(P<0.01).［Conclusion］The results suggest that mitochondrial ultrastructure could be damaged severely and respiratory function decreases significantly after SCI.
Key words：spinal cord injury; mitochondria; ultrastructure
线粒体等亚细胞器在中枢神经系统损伤后的继发性损伤中起重要作用。神经元死亡是一些神经系损伤的共同特征，其中线粒体功能失调以及由线粒体介导的神经细胞凋亡在其发生、发展中起重要作用［1］。细胞生命活动所需能量90%以上由线粒体氧化磷酸化提供。当线粒体内能源物质合成障碍，细胞内各种耗能的生物反应中断，可引起一系列变化，如氧自由基生成增加，离子泵功能受损，细胞内Ca2+超载，细胞膜通透性增高，细胞肿胀坏死［2］。目前有关脊髓损伤后线粒体等细胞器超微结构和功能变化的报道较少。
1 材料与方法
1.1 动物分组
健康成年SD大鼠48只，雌雄不限，体重250±30 g，随机分组为对照组（假手术组）和脊髓损伤组（SCI组），每组又分为处理后6、12、24 h三时相组(每组8只)，提取伤段脊髓线粒体，分别测定线粒体呼吸Ⅲ态（R3）、呼吸Ⅳ态（R4）、呼吸控制率（RCR）、磷氧比（P/O）和线粒体内游离钙等指标。
1.2 模型制备
1﹪戊巴比妥钠以40 mg/kg体重行腹腔麻醉，以T8、9为中心，暴露T8、9段脊髓，在暴露的硬膜表面放置一3 mm×2 mm的弧形垫片。采用Allen’s脊髓重物打击损伤模型，致伤能量10 g×5 cm。术后处理：室温维持在23～25℃，保持干燥通风。每只大鼠分笼饲养，不限制进食和饮水，术后定时协助脊髓损伤大鼠排尿、排便。
1.3 脊髓线粒体提取
根据Estabrook［3］法，各组在伤后相应时间取出伤段脊髓，用预冷生理盐水冲洗脊髓，滤纸吸干后称重。按16 ml/g比例加入分离介质至Teflon芯匀浆器中，匀浆。将匀浆液倒入预冷的离心管中，3 000 r/min离心10 min，取上清后配平，15 000 r/min离心10 min。弃去上清，沉淀部分再用分离介质充分漂洗，15 000 r/min离心10 min。弃去上清，沉淀中加入少许分离介质，约0.5ml，充分打匀制成线粒体悬液约10 mg/ml，置于冰浴中待用。整个分离过程在冰浴中进行，离心在0～4℃条件下进行。
1.4 线粒体功能指标测定
采用Clark氧电极法［1］测定线粒体呼吸功能：氧电极表面用蒸馏水洗净，表面向上加入0.5 mmol/L KCl溶液数滴，盖上约3 cm×3 cm的清洁薄膜并固定。将电极小心嵌入电极杯底部。向反应杯内加满蒸馏水，搅拌，并使反应室温度维持在30℃，30 min后电极达到平衡，此时不盖反应室瓶盖，反应杯内的氧与大气取得平衡，然后进行标定。控制器各旋钮都放在最小位置，然后慢慢开大灵敏度旋钮，使记录仪指针达到满刻度。稳定后在反应杯中加入少量连二亚硫钠粉末，以除尽水中的氧，并立即盖紧瓶塞，记录笔逐渐向零位退回。根据氧饱和溶解度计算记录纸上每小格氧含量（30℃时水中氧的饱和溶解度为0.23 μmol/ml，计算公式为：每小格氧含量（μmol）=0.23×2.5÷退回的格数）。将平衡记录仪走纸速度设定为8 mm/min。吸干反应杯内的标定溶液，用蒸馏水反复冲洗2～3次后吸干，加入测定介质2.5 ml，盖紧玻璃塞，打开电磁搅拌器，使测定介质达到所需温度。自小孔内加入1 mg线粒体，孵育1 min后，由小孔内加入20 μl琥珀酸，2 min后加入ADP 10 μl，得到的曲线为呼吸Ⅲ态，ADP耗尽后得到的曲线为呼吸Ⅳ态。计算公式
(1) 呼吸Ⅲ态（R3）= 每小格氧含量×每分钟Ⅲ态耗氧格数（nmol O/mgpr/min）
(2) 呼吸Ⅳ态（R4）= 每小格氧含量×每分钟Ⅳ态耗氧格数（nmol O/mgpr/min）
(3) 呼吸控制率（respirtory control rate,RCR）= 呼吸Ⅲ态/呼吸Ⅳ态
(4) 磷氧比（P/O）= ADP浓度(nmol)/ 呼吸Ⅲ态耗氧量(nmol O)
透射电镜观察线粒体超微结构的改变。取各组脊髓组织提取的线粒体1 mm3见方的小块，2%戊二醛PBS固定液4℃前固定1 h，0.1mol/L磷酸缓冲液（PB，PH7.4）洗涤10 min×2次，4℃过夜。1%锇酸（0.1 mol/L PB配制）4℃后固定2 h，PBS缓冲液4℃洗涤10 min×2次，30%、50%、70%、100%乙醇逐次脱水各10 min，90%乙醇-90%丙酮、90%丙酮、3次100%丙酮脱水各10 min，环氧乙烷置换每次10 min×2次， 618包埋液与环氧乙烷（1:1）浸透2 h，618包埋液与环氧乙烷（1:2）浸透过夜，纯618包埋液37℃浸透2 h，60℃烘箱内48 h包埋。618包埋液与环氧丙烷浸透包埋，切厚片定位后，进行超薄切片，捞于铜网上。枸橼酸铅电子染色，透射电镜观察 。
1.5 统计学处理
所有参数用±s表示，用t检验判定各实验组之间差异显著性。P<0.05有显著统计学意义，P<0.01有极显著统计学意义。
2 结 果
2.1 线粒体超微结构的改变（图1）
电镜下，对脊髓神经元线粒体形态、突触、细胞核以及其他细胞内膜结构等进行重点观察。正常脊髓组织内线粒体多呈圆形或椭圆形,线粒体膜结构清楚、嵴致密、排列整齐(图1) 。SCI组脊髓组织线粒体体积增大,嵴稍肿胀,嵴内腔扩大,部分线粒体出现膜结构不清、嵴紊乱（图2）。
随着损伤后时间的延长，可见部分线粒体嵴开始断裂溶解，膜破裂和线粒体数量减少等(图3，4)。
2.2 线粒体的呼吸功能和氧化磷酸化的变化（表1～4）
表1～3显示SCI组在伤后6h、12h和24h R3和RCR显著低于对照组，R4显著高于对照组，有极显著统计学意义（P<0.01）。表明脊髓损伤后伤段脊髓线粒体内膜底物通透性、呼吸链和ATP/ADP移位体等明显受到影响，线粒体氧化磷酸化的偶联程度明显受到抑制。
线粒体的P/O直接反应了线粒体氧化磷酸化的变化。表4显示SCI组在伤后各时相P/O明显低于对照组，有极显著统计学意义（P<0.01）。说明伤后伤段脊髓线粒体利用氧化释放能量转化为ATP的效率明显降低。表1 线粒体R3变化表2 线粒体R4变化
3 讨 论
近年来研究发现，线粒体功能正常与否，是决定细胞生存或死亡的关键因素。细胞能量代谢障碍，以及细胞凋亡或坏死等一系列细胞病理反应过程，都与线粒体的结构和功能异常有关。细胞生命活动所需能量90%以上由线粒体氧化磷酸化提供，因此，线粒体功能的改变直接影响神经细胞的功能。
图1 正常脊髓组织线粒体（×8 000）, 呈圆形或椭圆形,线粒体膜结构清楚、嵴致密、排列整齐 图2 SCI后6 h脊髓组织线粒体（×8 000）体积增大,嵴稍肿胀、紊乱,部分出现膜结构不清 图3 SCI后12 h脊髓组织线粒体（×8 000）,嵴稍肿胀、部分开始断裂和溶解 图4 SCI后24 h脊髓组织线粒体（×8 000）, 可见嵴断裂溶解、膜破裂
线粒体呼吸功能的重要参数有：R3、R4、RCR（RCR＝R3/R4）和P/O 比值［4］。R3 反映线粒体内膜底物通透性（底物载体）、呼吸链、ATP 合成酶和ATP/ADP 移位体等情况；R4 反映线粒体内膜天然质子传导性即内膜通透性的大小；RCR 反映线粒体结构完整及功能状态，是一个非常灵敏的指标，它直接反映氧化磷酸化偶联程度；P/O 比值是指线粒体利用氧化释放能量转化为ATP 的效率，是氧化磷酸化效率的重要指标，P/O 比值下降预示氧化磷酸化脱偶联。
研究发现脊髓和脑创伤后早期（伤后6～12 h）线粒体呼吸活性R3、RCR、P/O 和OPR 均明显下降, R4 相对正常或升高［5］。本实验中SCI组在伤后R3显著低于对照组，有极显著差异（P<0.01）；同时R4显著高于对照组，有极显著差异（P<0.01）； SCI组在伤后各时相RCR、P/O明显低于对照组，差异非常显著（P<0.01）。表明脊髓损伤后伤段脊髓线粒体内膜底物通透性、呼吸链和ATP/ADP移位体等明显受到影响，线粒体内膜通透性增加，也说明损伤的线粒体RCR的变化是由R3降低和R4升高共同变化造成。线粒体氧化磷酸化偶联程度明显受到抑制，利用氧化释放能量转化为ATP的效率明显降低。电镜病理学检查也发现SCI后神经元线粒体有明显损害，与线粒体功能障碍相符。
生物大分子结构是功能的基础，一般认为分子结构改变在先，功能改变在后，脊髓损伤后线粒体呼吸功能改变也必然反映内膜和基质的改变。这些改变可能机制有以下几方面: (1) 线粒体膜损伤: 创伤后膜通透性增加、肿胀, 内膜蛋白、脂类组分丢失,有序结构改变, 严重质子回漏,使H+ 泵发生障碍,甚至内膜去能化, 膜转运功能降低, 基质水肿, 氧化磷酸化功能降低, 电子传递活性下降, ATP 合成下降。脊髓损伤后抑制了ATP酶的活性，加重伤段脊髓水电解质的紊乱，最终导致线粒体膜加重。(2) 产生一些线粒体呼吸抑制剂或解偶联剂［6］：脊髓损伤后神经细胞膜上Ca2+ 通道开放, 细胞外Ca2+ 大量进入细胞内，引起细胞内Ca2+超载，同时激活磷脂酶, 使膜磷脂、脂肪酸释放, 游离脂肪酸增多。脊髓损伤时儿茶酚类分泌增加, 也可通过cAMP 激活甘油三酯脂肪酶, 脂肪酸释放增多。另外, 外伤后自由基产生增多, 膜肽链断裂、变性, 导致线粒体脂质变薄，流动性降低，出现毛孔，影响其氧化磷酸化。(3) 脊髓组织缺血、缺氧，使NADH不能经呼吸链氧化成NAD+，NAD+/NADH比值下降、抑制柠檬酸合成酶的活性，三羧酸功能下降,ATP合成减少。
内膜通透性损害即脱偶联的表现［7］。状态Ⅲ速率（R3）则依赖于状态Ⅲ中任何一个限速步骤，主要包括底物通透性（底物载体），底物脱氢酶、呼吸链、ATP合成酶和腺苷酸移位体。线粒体R4的增高可使线粒体内膜通透性增高，降低ΔμH+，进而可诱导线粒体释放其基质内的物质如细胞色素C等，激活caspase 9/3等蛋白酶，引起细胞凋亡。由于SCI组R4升高而R3降低，说明底物载体、底物脱氢酶和呼吸链均未受影响。因此R3的降低提示ATP合成酶活力降低或腺苷酸移位体的结构发生改变。腺苷酸移位体位于线粒体的内膜上，其蛋白结构的异常将影响ADP的转位从而影响ATP的合成。同样ATP合成酶活力的降低也使ATP合成减少，最终导致线粒体的能量代谢障碍。大量Ca2+进入细胞，细胞内Ca2+浓度增高抑制代谢活动，过量的Ca2+破坏线粒体的电子传递链，而终止ATP产生，也就是使所有依赖ATP的生命活动终止了，同时，大量乳酸堆积，产生大量自由基，加重了神经的继发性损伤。
因继发性脊髓损伤的病理机制复杂,有关线粒体在脊髓继发性损伤机制中的作用，如线粒体功能变化对神经细胞凋亡的影响以及其在神经细胞凋亡信号转导机制中的作用等问题仍有待进一步研究。
【参考文献】
［1］ Lemasters JJ.Selective mitochondrial autophagy，or mitophagy，as a targeted defense against oxidative stress，mitochondrial dysfunction，and aging［J］. Rejuvenation Res,2005,1：3-5.
［2］ Zorov DB. Mitochondrial damage as a source of diseases and aging:a strategy of how to fight these［J］. Biochim Biophys Acta,1996, 122:10-15.
［3］ 邵擎东,肖建如,杨金华,等.颈髓损伤对颈髓细胞线粒体膜流动性与线粒体呼吸功能的影响［J］.中华创伤杂志,2000,8：469-470.
［4］ Reers M,Kelly RA,Smith TW.Calcium and protein activities in rat cardiol mitochondria: effect of matrix environment on behaviour fluorescent probes［J］.J Biochem，1989,2: 131-142.
［5］ Vink R,Golding EM,Headrick JP.Bioenergetic analysis of oxidative metabolism following traumatic brain injury in rats［J］.J Neurotrauma,1994,3:265-268.
［6］ Zhuan ZH,Donald M,Bers. Time course of action of antagonist of mitochondrial Ca2+ uptake in intact ventricular myocytes［J］.Eur J Physiol,2002,445:132-138.
［7］ Stirling DP,Khodarahmi K,Liu J,et al. Minocycline treatment reduces delayed oligodendrocyte death, attenuates axonal die back, and improves functional outcome after spinal cord injury［J］. Neurosci,2004,9:2182-2190.
作者单位：南京医科大学第一附属医院骨科, 南京 210029