新生大鼠大脑皮层少突胶质前体细胞的培养分离及鉴定

【摘要】  ［目的］探讨新生（sprague dawley,SD）大鼠大脑皮层少突胶质前体细胞在体外条件下的生长情况及培养分离，以获得纯化的少突胶质前体细胞，为今后细胞移植治疗研究提供良好的种子细胞。［方法］出生48 h SD大鼠取大脑皮层进行混合胶质细胞的体外培养，原代培养第9～10 d时采用水平振荡、差速贴壁的方法分离、纯化少突胶质前体细胞，继续用定向培养基传代培养。相差显微镜观察少突胶质前体细胞在体外条件下的生长情况，免疫细胞化学技术进行细胞鉴定。［结果］混合胶质细胞原代培养第9～10 d时出现明显的细胞分层，少突胶质前体细胞散布于单层的星形胶质细胞表面，胞体呈椭圆形或圆形，具有典型的双极突起，少数呈三极突起。经振荡分离后少突胶质前体细胞纯度达95％，少突胶质细胞特异性标记Oligo2反应阳性，胶质纤维酸性蛋白抗体反应阴性。［结论］新生SD大鼠大脑皮层原代培养中少突胶质前体细胞能够维持在未成熟阶段，细胞分层后通过振荡法及差速贴壁法可以获得较高纯度的少突胶质前体细胞。

【关键词】  少突胶质前体细胞; 细胞培养； 脱髓鞘化； 脊髓损伤

Culture and isolation of oligodendrocyte precursor cells from neonatal rat  cerebral cortices∥WU Bo, REN Xianjun.   Department of Orthopedics, Xinqiao Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400037,China

    Abstract：［Objective］To observe the growth pattern of oligodendrocyte precursor cells (OPCs) in the primary culture from neonatal rat cerebral cortices and study the methods of cell culture and isolation in order to obtain purified OPCs for the experiments of cell transplantation.［Method］The mixed glial cells from the cerebral cortices of 48hourold SpragueDawley (SD) rats were cultured in vitro. Until 9-10 days in vitro OPCs were isolated  and purified by the shaking process and differential adhesion, and then continued OPCs culture in the defined medium. The growth pattern of OPCs in vitro was investigated by contrast phase microscopy and OPC  s were further identified with the immunocytochemical techniques.［Result］The distinct stratification of OPCs and astrocytes developed around 9-10 days in primary culture. At this point, the OPCs scattered on the top of the monolayer astroctyes and the soma of most OPCs typically appeared oval or round with two or three processes. The purity of the isolated OPCs reached 95% and these OPCs further developed into the mature oligdendrocytes which  were immunoreactive to the specific antigen of oligodendrocyte lineage cells, Oligo2. ［Conclusion］OPCs separated from the cerebral cortices of neonatal SD rats can be maintained as immature precursor cells in culture, and OPCs are able to be purified by shaking and differential adhesion under the condition of appropriate cell stratification.

    Key words：oligodendrocyte precursor cell;  cell culture;  demyelination;  spinal cord injury

    脊髓损伤是一种常见的中枢神经系统损伤，可以造成患者严重的神经功能损害。目前，临床上尚无有效办法治疗脊髓损伤。随着研究深入，人们对于脊髓损伤的病理过程有了更进一步的认识。脊髓损伤不仅导致神经元丢失，同时还造成大量少突胶质细胞的死亡，从而引起残留神经轴突的脱髓鞘改变，进一步影响了脊髓神经功能的恢复。近来不少研究显示通过髓鞘形成细胞移植治疗脊髓损伤，有利于脱髓鞘轴突的再髓鞘化，促进损伤脊髓的神经功能恢复［1,2］。研究表明，少突胶质细胞不仅形成髓鞘包绕轴突，同时它还起着为其他神经细胞提供营养因子、促进轴突生长等作用［3］。此外，少突胶质前体细胞是处于分化早期阶段的未成熟细胞，既能够定向分化为成熟少突胶质细胞，同时又具有一定的增殖与迁移能力［4］，更加适合于细胞移植治疗。因此，研究少突胶质前体细胞移植治疗脊髓损伤，促进脱髓鞘轴突再髓鞘化具有重要的意义。经体外培养获得大量少突胶质前体细胞是开展这些实验研究的重要前提，故本实验就如何获得纯化的少突胶质前体细胞进行初步探讨。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    出生48 h的新生（sprague dawley,SD）大鼠，雌雄不限，由第三军医大学实验动物中心提供。体视显微镜(Leica)，中低速冷冻离心机(Heraeus)，超净工作台(苏州净化)，二氧化碳培养箱(Heraeus)，台式恒温振荡器(江苏太仓)，倒置相差显微镜(Leica)及74 μm细胞滤网、显微解剖器械等。

    Dulbecco's Modified Eagle Media(DMEM)(GIBCO)，Hanks平衡盐溶液(GIBCO)，标准胎牛血清(TBD)，多聚赖氨酸(Sigma)，L-谷氨酰胺(GIBCO)，丙酮酸钠(Amreseo)，牛胰岛素(Sigma)，转铁蛋白(Sigma)，亚硒酸钠(Sangon)，甲状腺素(Sigma)，台盼蓝(Sigma)，兔抗人胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein, GFAP)多克隆抗体(中杉金桥)，兔抗人少突胶质细胞转录因子2(Oligodendrocyte lineagespecific transcription factor,Oligo2)多克隆抗体(中杉金桥)，ABC试剂盒(中杉金桥)，DAB试剂盒(中杉金桥)。

    基本培养基：DMEM含10％胎牛血清、0.6%葡萄糖、4 mmol/L谷氨酰胺、5 mmol/L丙酮酸钠、50 u／ml青霉素、50 μg／ml链霉素。定向培养基：DMEM含0.5％胎牛血清、50 μg/ml转铁蛋白、5 μg/ml胰岛素、30 nmol/L亚硒酸钠、30 nmol/L甲状腺素、4 mol/L L谷氨酰胺、5 mmol/L丙酮酸钠、50 u／ml青霉素、50 μg/ml链霉素。

    1.2  少突胶质前体细胞培养

    混合胶质细胞培养：取新生48 h SD大鼠，颈动脉放血，在体视显微镜下无菌取出大脑半球，切除脑干及海马，彻底清除脑膜、血管等组织，转入Hanks平衡盐溶液内清洗皮层组织。用显微解剖剪小心剪碎皮层至约1 mm3大小的组织块，轻柔吹打制成细胞悬液，74 μm筛网过滤，收集细胞滤液并离心(1 000 r/min 4℃，10 min)，以1.0～2.0×106个细胞接种于预先包被多聚赖氨酸的75 cm2玻璃培养瓶内(大约1只新生大鼠皮层的细胞接种1瓶)，加入基本培养基约8～10 ml，入体积分数为0.95空气和0.05二氧化碳的37℃细胞培养箱内孵育。最初3 d内不要振动培养瓶，约3～4 d进行第1次换液，以后根据培养液情况每2～3 d进行换液，培养至9～10 d时根据星形胶质细胞融合及细胞分层情况进行振荡分离。

    振荡分离和纯化：振荡前更换新鲜的基本培养基孵育24 h，转移培养瓶至恒温水平振荡器上进行初步振荡分离(180 r/min，37℃，1～2 h)，吸出上层细胞悬液去除小胶质细胞等。用Hanks平衡盐溶液清洗培养瓶3次，加入基本培养基8～10 ml，入培养箱内继续孵育2 h，再次将培养瓶置于振荡器上进行过夜振荡分离(200 r/min，37℃，18～20 h)。收集振荡后细胞悬液，74 μm筛网过滤，收集滤液并离心(1000 r/min，4℃，10 min)。用2～3 ml基本培养基重新悬浮细胞并接种于未包被多聚赖氨酸的100 cm2玻璃培养皿内，入细胞培养箱孵育约1 h，用培养基轻轻吹打培养皿表面数次以使松散贴附的细胞脱落，收集细胞悬液再次离心(1 000 r/min，4℃,10 min)。用基本培养基重新悬浮细胞并进一步接种于包被多聚赖氨酸的培养瓶或培养板上，入细胞培养箱孵育15～20 min。吸出培养瓶内或培养板上的基本培养基，用Hanks平衡盐溶液清洗3次，沿培养瓶板边缘缓慢加入定向培养基，入细胞培养箱继续孵育。

    1.3  培养细胞的形态观察及鉴定

    形态学观察：采用倒置相差显微镜观察原代细胞培养中少突胶质前体细胞的基本生长规律及其形态特征，拍照记录细胞形态。   

    细胞活性检测：台盼蓝染色法检测分离的少突胶质前体细胞活性能力。

    免疫细胞化学鉴定：定向分化培养3～5 d时，吸出培养基后Hanks平衡盐溶液清洗玻片数次，用4%多聚甲醛固定，按照免疫细胞化学常规方法进行抗Oligo2和抗GFAP染色鉴定。一抗为兔抗人Oligo2(1∶100)和兔抗人GFAP(1∶50)，二抗为山羊抗兔IgG(SP 9 000，中杉金桥)，DAB试剂盒显色，脱水，透明，中性树胶封片。阴性对照以0.01 mol/L PBS代替一抗进行染色。光镜下计数并分析Oligo2阳性细胞比例。

    2  结果

    混合培养的胶质细胞进行原代培养7～9 d左右出现明显的细胞分层，下层为星形胶质细胞，互相连接形成比较紧密的单一细胞层。少突胶质前体细胞则迁移至星形胶质细胞单层上面，散在或成簇分布，大多数细胞胞体呈椭圆形或圆形，具有典型的双极突起，少数为三极突起(图1）。通过振荡分离和差速贴壁可以获得较高纯度的少突胶质前体细胞，台盼蓝排除试验结果显示振荡分离后细胞的存活率>98％。将分离纯化的少突胶质前体细胞进行定向分化培养3～5 d后，形态学观察分析显示少突胶质前体细胞分化为成熟少突胶质细胞，胞体较小呈圆形或椭圆形，突起多且细短，呈“分枝”或“蜘蛛网”状分布于胞体四周，抗少突胶质细胞特异性标记Oligo2染色呈阳性(图2)。分离纯化后绝大多数细胞呈Oligo2标记免疫阳性，个别细胞呈GFAP标记免疫阳性(图3)，提示少量星形胶质细胞混杂。光镜下计数Oligo2阳性细胞数达95％，空白对照组结果为阴性。

    3  讨  论

    研究表明，脊髓损伤后轴突脱髓鞘改变是重要的病理变化之一。脊髓损伤中少突胶质细胞大量死亡进而引起神经轴突脱髓鞘变化，严重影响了残留神经纤维的功能发挥。早期研究显示脊髓损伤后改善脱髓鞘轴突的电生理异常有助于改善损伤脊髓神经功能。近年来，不少研究结果也表明脊髓损伤后补充髓鞘形成细胞能够促进脱髓鞘轴突再髓鞘化、改善脊髓神经功能［1,2］。移植后的少突胶质前体细胞一方面能够避免移植微环境的不利影响，定向分化为成熟少突胶质细胞；同时另一方面还具有一定的增殖及迁移能力，有助于其在移植局部发挥治疗作用［4,5］。因此，通过体外培养获得纯化的少突胶质前体细胞，对后续细胞移植治疗脊髓损伤的研究具有重要意义。

    图1  新生48 h SD大鼠大脑皮层细胞体外培养  图1a  原代培养第9 d时形成明显的细胞分层。低倍镜下观察，下层为融合的星形胶质细胞单层，上层为散在分布的少突胶质前体细胞层(箭头)  图1b  高倍镜下观察，少突胶质前体细胞散在或成簇分布于星形胶质细胞表面。胞体呈椭圆形或圆形，具有典型的双极或三级突起(箭头)。标尺=200 μm(A)和50 μm(B)  图2  振荡分离后定向分化培养5 d，少突胶质前体细胞分化为成熟少突胶质细胞  图2a  分离纯化的少突胶质细胞呈特异性抗体Oligo2反应阳性，阳性部分为细胞核(箭头)  图2b为图2a所对应的细胞图像，成熟少突胶质细胞胞体较小，呈圆形或椭圆形，突起多、细短，呈典型的“蜘蛛网”状分布于胞体四周(箭头)。标尺=20 μm(A、B)  图3  振荡分离后个别混杂的星形胶质细胞。细胞较扁平、宽大，无明显突起，星形胶质细胞特异性抗体GFAP反应阳性，阳性部位为细胞浆，胞核复染苏木精(箭头)。标尺=100 μm。

    本实验以Armstrong［6］所采用的少突胶质前体细胞培养分离方法为基础进行改进。经体外培养获得一定数量的少突胶质前体细胞，必须以少突胶质前体细胞的增殖为前提。本研究观察到原代培养第9～10 d左右，此时混合培养的胶质细胞出现明显的分层。下层的星形胶质细胞基本融合成片，与此同时少突胶质前体细胞也迁移至星形胶质细胞表面，增殖成簇或呈“葡萄串”样散布于其上。实验中选择合适的振荡分离时机是纯化少突胶质前体细胞的关键。若原代培养时间过短(一般<7 d)星形胶质细胞通常未能融合成片，并且少突胶质前体细胞也未能充分迁移、增殖。若原代培养时间过长(一般>14 d)，少突胶质前体细胞因死亡而数量逐渐减少，且振荡分离时下层的星形胶质细胞也容易大片撕脱不利于纯化［7,8］。除分离时机的选择以外，预振荡和差速贴壁也是提高少突胶质前体细胞纯度的重要步骤。实验中进行了2次振荡分离。第1次振荡时间较短为1～2 h，振荡速度也较慢(180 r/min)，目的是为了预先去除混杂的小胶质细胞。因小胶质细胞具有易贴壁、易脱壁的特性，故通过较短时间、较慢速度的振荡即可将其分离去除，而不干扰少突胶质前体细胞。第2次振荡时间长、振速快，经过夜振荡所分离的少突胶质前体细胞悬液内多少混杂有少量星形胶质细胞。实验进一步将此细胞悬液接种于未包被多聚赖氨酸的培养皿上，利用星形胶质细胞和小胶质细胞易贴壁的特性，吹打掉不易贴壁的少突胶质前体细胞以进一步提高分离纯度。此外，过夜振荡时间和速度的选择也对少突胶质前体细胞的良好分离有着重要影响。振荡频率过快(>250 r/min)、振荡时间过长(>24 h)或振荡频率过慢(<180 r/min)、振荡时间过短(<18 h)均不利少突胶质前体细胞的分离纯化［7,8］。

    研究表明，大鼠出生约1周时少突胶质前体细胞逐渐成熟，开始形成髓鞘包绕轴突。本实验从新生48 h大鼠大脑皮层取材能够获得尚未完全成熟的少突胶质前体细胞。实验中混合胶质细胞培养7～9 d左右出现细胞分层，下层为融合成片的星形胶质细胞单层，上层为少突胶质前体细胞散在或成簇分布于星形胶质细胞表面，大多数前体细胞胞体呈椭圆形或圆形，具有典型的双极或三极突起，为少突胶质前体细胞形态的特征表现。此外，分离纯化的少突胶质前体细胞能够继续在低血清定向培养基中生长，培养3～5 d时少突胶质前体细胞进一步分化为成熟少突胶质细胞，具有典型的“蜘蛛网”或“多分枝”状突起，少突胶质细胞特异性标记免疫反应阳性。综上所述，本实验结果表明，适时的原代培养，恰当的振荡分离，结合差速贴壁等方法是获取较高纯度的少突胶质前体细胞的有效手段。   

【参考文献】
  ［1］ Totoiu MO,Keirstead HS．Spinal cord injury is accompanied by chronic progressive demyelination［J］．J Comp Neurol，2005，4：373-383．

［2］ Bo W，Xianjun R,Shuzhang G．Reseach advancements of axonal remyelination in spinal cord injury［J］．Journal of Medical Colleges of PLA,2007，4：250-254．

［3］ 胡建国，陆佩华，徐晓明．少突胶质细胞生物学功能与相关疾病研究进展［J］.生理科学进展，2004，1： 39-41．

［4］ Faulkner J，Keirstead HS．Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitors for the treatment of spinal cord injury［J］．Transpl Immunol，2005，2：131-142．

［5］ 吴 波，任先军，郭树章．定向分化神经前体细胞移植治疗脊髓损伤［J］．中国矫形外科杂志，2008，4：279-281．

［6］ Armstrong RC．Isolation and characterization of immature oligodendroeyte liheage cells［J］．Methods，1998， 3：282-292．

［7］ 卜曙阳，黄 强，徐国旭，等．新生小鼠视神经少突胶质细胞系定向分化培养及鉴定［J］．江苏医药，2005，7:527-529．

［8］ 殷红兵，丁爱石，吴卫平，等．新生大鼠高纯度少突胶质前体细胞系细胞的培养与鉴定：改良振荡分离纯化法的特点［J］．中国临床康复，2005，17：36-37．

作者单位：第三军医大学新桥医院骨科，重庆