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【摘要】 ［目的］ 运用基因芯片技术探索骨肉瘤发病及转移相关基因，研究基因表达水平对于骨肉瘤发生及转移的重要意义。［方法］ 采用2个公认的骨肉瘤细胞株及1个成骨细胞株，提取总RNA,合成生物素标记的cRNA与SBC基因芯片杂交。随机挑选4个差异表达基因，分别设计合成引物，用嵌合荧光法（SYBR Green I）实时RT-PCR法定量测量术中收集的新鲜骨肉瘤标本及两株细胞中各基因的表达水平，应用ABI Prism 7 300分析其与成骨细胞株之间的表达差异。［结果］以表达差异≥2.0或≤0.5倍为限，在SBC芯片包含的所有基因（约15 000个转录本）中，2个骨肉瘤细胞株与成骨细胞株相比较，共同上调189个基因；共同下调84个基因。随机挑选4个差异表达基因的实时RT-PCR结果与芯片结果完全相符。［结论］骨肉瘤是一种多基因病变,应用基因芯片技术有助于发现该肿瘤的基因变化规律。
【关键词】 骨肉瘤; 基因微矩阵； 基因
Investigation of relevant genes to the pathogenesis and metastasis of osteosarcoma with SBC gene microarray∥CAO Lei,JI Fang,CAI Xiao-bing,et al.Department of Orthopaedics, Changhai Hospital，the Second Military Medical University，Shanghai 200433，China
Abstract: ［Objective］To investigation the relavant genes to the pathogenesis and metastasis of osteosarcoma,and to discuss the significance of gene expression in the pathogenesis and metastasis of osteosarcoma. ［Method］Two well-known ATCC osteosarcoma cell lines and an osteoblastic cell line were collected. After the total RNA was extracted,the finally synthesized biotinylated cRNAs were hybridized to SBC arrays.After the design and synthethesis of the primers,four of the differentially expressed genes were then chosen at random to further confirm the array results using the SYBR Green real-time RT-PCR method in freshly collected osteosarcoma specimens and the cell lines.The data analysis depended on the ABI Prism 7300 system.［Result］By an entrance limit of ≥2.0 or ≤0.5, 189 up-regulated and 84 dowm-regulated genes which were considerable differentially expressed in the two osteosarcoma cell lines compared with the osteoblastic cell line hfob1.19 were finally detected.Many of the genes were first reported to be related to the pathogenesis of osteosarcoma. The array results were further confirmed by the real-time RT-PCR.［Conclusion］Many genes are involved in the pathogenesis and metastasis of osteosarcoma. It is helpful to apply gene array to find the laws of gene expression and to study the gene-gene interactional relationships in this tumor.
Key words：osteosarcoma; gene microarray; gene
目前研究认为，骨肉瘤的发生与癌基因激活，抑癌基因失活及其它基因的表达失控有关，是多种相关基因多阶段多途径协同作用的结果。基因芯片又称DNA芯片或DNA微阵列，该技术由于采用了微电子学的并行处理和高密度集成的概念，具有高效、高信息量的突出优点。本实验以骨肉瘤细胞系（MG-63，U-2OS）和成骨细胞系hFOB1.19为研究对象，应用SBC的人16K基因表达谱cDNA芯片(含已知基因12581个)，通过一次重复，鉴定已知基因在骨肉瘤细胞与正常成骨细胞中的差异表达情况，并以临床切除的骨肉瘤新鲜标本及两个骨肉瘤细胞系为对象，进一步在mRNA水平上对显著差异表达的基因进行了验证。统计学分析表明，由基因芯片筛选到的差异表达基因与骨肉瘤的发病与转移密切相关。骨肉瘤的发病及转移是一个包括癌基因、抑癌基因、肿瘤相关基因等多基因参与的复杂过程。
1 材料与方法
1.1 主要材料与试剂
两个骨肉瘤细胞系（MG-63、U-2OS）及一个成骨细胞系(hFOB1.19)购自中国科学院上海细胞所。MEM、McCoy’s 5a培养基、10%灭活胎牛血清、0.3 mg/ml G418、TRIzol试剂购自GIBCO公司，Ham’s F12及无酚红DMEM培养基（1∶1）均购自SIGMA公司。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。反转录试剂由invitorge公司提供；定量PCR试剂为ABI power SYBR green PCR master mix (ABI, USA)；引物由上海英骏生物技术有限公司合成；定量PCR仪型号为7 300 Sequence detection system (ABI, USA)。实验所用的骨肉瘤组织标本为2007年12月份第二军医大学长海医院骨科手术切除标本。术中切除后立即置入液氮罐中冻存备用。患者男性，25岁，为右股骨远段骨肉瘤，组织样本均经长海医院病理科免疫病理确诊为骨肉瘤，其组织分型为成骨细胞型。
1.2 细胞培养
MG-63采用MEM培养基，添加10%灭活胎牛血清；U-2OS采用McCoy’s 5a培养基，添加1.5 mmol/L-谷胺酰胺及10%灭活胎牛血清。两个骨肉瘤细胞株（MG-63、U-2OS）均在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。hFOB1.19成骨细胞株在34℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，所用的Ham’s F12及无酚红DMEM培养基（1∶1）中添加2.5 mmol/L-谷胺酰胺、10%灭活胎牛血清。所有用于芯片实验的细胞均处于对数生长期。
1.3 实验细胞株总RNA抽提及探针合成
将三个实验用细胞株各收集1×107左右的细胞用于抽提总RNA。采用TRIzol法抽提总RNA、QIAGEN RNAeasy mini kit纯化总RNA（具体见QIAGEN公司提供的说明手册）。抽提总RNA的浓度和质量采用分光光度计及琼脂糖胶电泳测定。只有当A260/A280吸收率为1.9～2.11且28S/18S RNA 亮度比值≥2且者才继续进行之后的操作。芯片杂交剩余的RNA保存于-80℃冰箱备用。
双链cDNA的合成、荧光标记cRNA的合成以及cRNA的片段化等过程严格遵循SBC芯片表达分析实验方法。根据以上实验方法，cDNA的第1链、第2链以T7 promotor primer为引物配制cDNA合成体系运用一步法合成；cRNA合成后以QIAGEN RNAeasy mini kit纯化cRNA，以分光光度计分析cRNA浓度；cRNA以荧光染料标记（cy3标记肿瘤细胞，cy5标记成骨细胞）后同上述方法进行纯化并定量。（具体操作步骤详见SBC cDNA表达谱芯片操作指南）。
1.4 芯片杂交
cy3探针90 pmmol、cy5探针60 pmmol配制成杂交液后滴加与芯片上杂交过夜（芯片各做1组重复，共4张）。芯片杂交后的洗涤、染色过程遵照标准的SBC表达谱芯片实验指南进行。
1.5 数据分析
芯片结果采用Aligent Scanner来获取图像，通过Imagene转化为数值后应用Genespring分析软件将数值进行标准化，取得Ratio值。一般认为Ratio值在0.5～2.0范围内的基因不存在显著的表达差异，而在该范围之外的基因被认为表达出现显著改变。作者将两个骨肉瘤细胞株与成骨细胞株之间差异表达平均倍数（芯片重复一次）≥2.0倍或≤0.5者筛选出来，从筛选出的基因（2组上调、2组下调）中选择两组骨肉瘤细胞株相对成骨细胞株共同差异表达的基因（上调和下调）。具体见实验结果。对共同差异表达基因的分析借助于GenBank数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank）、Genespring等综合完成。
1.6 实时定量RT-PCR验证
骨肉瘤组织标本总RNA用一步法（TRIzol试剂，GIBCO/BRL公司）提取后全部保存在-80℃冰箱备用。
cDNA第1链合成：从-80℃冰箱中取出骨肉瘤组织及3个细胞株RNA，在室温下解冻，然后在0.2 ml PCR管中配制反应溶液；将反应管置于PCR仪中,65℃预变性5 min；变性反应结束后在PCR管中配制cDNA第1链合成反应体系（5X first-strand buffer 4.0 μl、0.1 MDTT 2.0 μl、RNA inhibitor 1.0 μl、Superscript II 1.0 μl）；将PCR管子置于PCR仪中进行探针标记反应，42℃保温50 min后，70℃变性15 min，4℃保存。
引物的设计：登录GENEBANK网站，以4个差异表达基因为模版设计上、下游引物，引物的合成由上海英骏生物技术有限公司（具体见表1）。表1 定量PCR引物列表基因名称Genbank号
嵌合荧光法（SYBR Green I）实时RT-PCR：采用ABI SYBR Green RT-PCR方法（具体反应体系见ABI SYBR Green RT-PCR方法说明）50℃孵育2 min；然后95℃，10 min；接着进行45个循环，95℃，15秒；60℃，1 min。仪器使用ABI Prism 7 300。
2 结果
2.1 骨肉瘤细胞株与成骨细胞株差异基因表达情况
以表达差异≥2倍或≤0.5为限，在SBC人16K基因表达谱cDNA芯片包含的约12 581个已知基因中，2个骨肉瘤细胞株与成骨细胞株hFOB1.19分别的差异表达情况如下：MG-63上调842个基因，下调1 255个基因；U-2OS上调1 040个基因，下调1 430个基因（差异基因功能分类见表2）。
表2 MG-63、U-2OS与hFOB1.19相比较差异基因功能分类MG-63上调MG-63下调U-2OS上调U-2OS下调凋亡或肿瘤相关120225147235结合226350294384代谢138205165249细胞周期5210380115信号转导6510977108物质运输38435867转录调控35605560酶调节22431639未知功能28383443 注：MG-63上调代表MG-63与hFOB1.19相比较上调的基因数量，类推其他三项。基因初步功能分类为16大类，本表列举主要的9类。 两者与成骨细胞株相比较共同上调189个基因；共同下调84个基因。
在189个共同上调基因中，作者选取了MUC1（平均上调5.513和3.297倍）和ASS基因（平均上调达16.18、3.234倍）在组织标本及细胞株中对其表达进行定量PCR验证。
在84个共同下调基因中，我们选择了IL-1B（平均下调0.019和0.01倍）、GDF15（平均下调0.0 232和0.0 473倍）两个基因在组织标本及细胞株中对其表达进行定量PCR验证。
2.2 4个差异表达基因的实时定量PCR验证
作者采用实时定量PCR的方法验证了上述4个基因在临床切除的1例骨肉瘤标本及2个骨肉瘤细胞株与成骨细胞株细胞相比较的差异表达情况。结果表明：在mRNA水平上，与成骨细胞株hFOB 1.19相比，原发骨肉瘤组织标本及骨肉瘤细胞株显示与SBC芯片同样的差异表达情况（见表3），这进一步验证了芯片结果的可靠性。
3 讨论
虽然大量的研究结果表明骨肉瘤这种恶性程度极高的骨肿瘤在分子和细胞遗传学上具有一些较普遍的、显著的改变，但时至今日，骨肉瘤发病的分子遗传学背景仍未探明。本研究中，作者使用骨肉瘤细胞株作为模型用以研究基因表达水平对于骨肉瘤发病及演变的重要意义。通过使用基因芯片技术，作者在基因组水平共筛查到273条共同显著差异表达基因（含上调和下调基因各189和84条）。而后，作者挑选了4条显著差异表达基因，在1例临床切除并经病理证实的骨肉瘤组织标本及3个实验细胞株中使用嵌合荧光实时RT-PCR方法定量进行了验证。在差异表达基因的初步分析中，作者发现其中一部分基因与骨肉瘤发病、转移密切相关，而且在国内外尚未见报道或尚未引起重视。表3 4个基因在骨肉瘤组织标本中的定量PCR验证情况列表各基因△Ct值/差异倍数MUC1ASSIL-1BGDF15MG-631.7481/109.0312.5149/48.0819.1258/0.005811.3066/0.0052U2-OS6.4044/4.3247.0747/2.03915.1258/0.000110.0759/0.0122肉瘤标本6.3867/4.3776.5676/2.7228.0846/0.01198.4683/0.0373hFOB1.198.5167/1.08.1023/1.01.6876/1.03.7236/1.0 注：Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，△Ct值是样品Ct值减去管家基因（GAPDH）Ct值的差值。因为作者认为管家基因的表达量在总mRNA中的比例是恒定的，因此基因A在样品1和样品2中的表达量比值为2-（ΔCt1-ΔCt2）。在本表中，上调基因差异倍数均≥2.0，下调基因差异倍数均≤0.5倍 在筛选出的差异基因中，无论上调基因还是下调基因，基本上包括所有功能的基因，但凋亡或肿瘤相关基因，代谢、结合、细胞周期、信号转导基因占绝大多数（见表2），这更充分说明骨肉瘤的发生、演变与多个基因相关，是多因素、多途径作用的结果。骨肉瘤的发生、发展与肿瘤相关基因、细胞的调亡、代谢密切相关。
与对照成骨细胞株相比，骨肉瘤细胞株显著共同差异表达的189个上调基因中包括了一些与能量代谢、物质代谢密切相关的基因，如USP13、LOC220594、TSTA3、SENP7、PLCB1、NNT、NNMT等，这很显然与骨肉瘤细胞的高代谢、高分化状态有关，包括了一些细胞周期基因，如JRK、HOXC10、DLG5等基因，还包括结合、信号转导、物质运输及未知功能基因等。而另外一些显著上调的肿瘤相关基因引起了作者的重视，如与肿瘤发生及转移有关的基因RASSF5、CDH11等。作者还发现有相当数量的肿瘤相关基因在骨肉瘤细胞株中显著高表达，这些肿瘤相关基因尽管已明确与多种其他系统肿瘤密切相关，但尚不知与骨肉瘤有无确切关系。（1）TPD52∶TPD52已被证实在前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、恶性淋巴细胞瘤、白血病等多种肿瘤组织中高表达［1～4］。一些学者更指出TPD52是候选癌基因。在作者以往的研究已证明TPD52在骨肉瘤中呈高表达，未引起注意，本次实验再次表明，TPD52表达水平提高与骨肉瘤的发病具有密切联系，值得密切关注。（2）CLU：Yan Lu［5］等采用大宗病历分析在20种常见肿瘤（不包括骨肉瘤）中筛选共同差异基因并进行验证后的得出CLU在常见肿瘤组织中呈高表达，这与作者的实验结果相符合，因此可以设想这种基因的表达产物是否可成为一种新的肿瘤标记物。（3）LSP1：编码淋巴细胞特异性蛋白，有报道它的高表达与乳腺癌、黑色素瘤相关［6～7］，本次实验中，平均差异达12.81倍，强烈提示它与骨肉瘤的发生和演进有关。（4）MUC1：在以往的研究中，MUC1的过度表达与乳腺癌、甲状腺癌、结肠直肠癌等上皮源性肿瘤的增殖、分化及侵袭性密切相关［8～10］，目前尚无报道MUC1的表达与骨肉瘤的关系，作者的实验及验证证实MUC1可能与骨肉瘤的发生及恶性侵袭性密切相关。
在显著共同差异表达的84个下调基因中，包括了一些早已在多种肿瘤中被证实了的抑癌基因，如：TXNIP、SIM2、RIS1等。还包括一些与肿瘤恶性进展、侵袭、转移密切相关的基因，如（1）CXCL6：已有多篇报道CXCL6的低表达与乳腺癌、卵巢癌的恶性侵袭及转移有密切的关系［11］，作者的实验提示其很有可能与骨肉瘤的恶性侵袭及转移有关；（2）SERPINB2：它的表达产物限制细胞的移动及降低细胞的侵袭性，SERPINB2在肿瘤细胞的高表达多次证明与肿瘤的低转移率及良好的预后有关［12］。骨肉瘤细胞SERPINB2表达明显下调可能与肿瘤细胞侵袭性、转移有密切的联系。在显著下调基因中，有相当数量的基因具有促使、介导凋亡的作用。如（1）NALP1：细胞凋亡蛋白Ced-4基因家族成员之一，定位与17p13，Ced家族是调控细胞凋亡的主要因子，此基因的过度表达已证实可诱发细胞凋亡［13］；（2）IL1A、IL1B：两者属于IL1家族九个成员之一，他们是炎症反应的强力诱导因子，并且在细胞增殖、分化、调亡中担当重要角色。
任何肿瘤的发生都是一个由多基因多因素参与的多步骤、分阶段的复杂过程。肿瘤发病和转移机制即包含了肿瘤发生、发展整个过程中的分子改变。在本次实验中，作者采用了基因水平上的筛查方法发现了与骨肉瘤发病密切相关的一些包括癌基因、抑癌基因在内的肿瘤发病相关基因，这些基因与骨肉瘤发病之间关系的无疑将对作者进一步研究骨肉瘤发病阶段特异性基因改变、肿瘤发病相关基因间的相互作用等具有重要的指导意义。
【参考文献】
［1］ Sooryanarayana V,Le H,et al.Defining aggressive prostate cancer using a 12-gene model［J］.Neoplasia，2006，8：59-68.
［2］ Pamela L P,Matthias DH,et al.Genomic profiling of hormone-nave lymph node metastases in patients with prostate cancer［J］.Neoplasia，2006，8:1083-1089.
［3］ Marci E S,Ben D,et al.Variation in gene expression patterns in effusions and primary tumors from serous ovarian cancer patients［J］.Mol Cancer，2005，4:26.
［4］ 曾恒,陈安民,李锋,等.骨肉瘤诱导分化与多药耐药表型的生物学性状比较［J］.中国矫形外科杂志,2007,15:1019-1022.
［5］ Yan L,Yijun Y,et al.Common human cancer genes discovered by Integrated gene-expression analysis［J］.Plos One，2007，2:1149.
［6］ Kornelia P. Breast cancer: origins and evolution［J］.J Clin Ivest，2007，11:3155-3163.
［7］ Ena W, Monica C，Panelli,et al.Melanoma-restricted genes［J］.J Transl Med，2004，2：34.
［8］ Joseph Z，Zaretsky, Itay Barnea,et al.MUC1 gene overexpressed in breast cancer: structure and transcriptional activity of the MUC1 promoter and role of estrogen receptor alpha (ERα) in regulation of the MUC1 gene expression［J］.Mol Cancer，2006，5: 57.
［9］ Kepal N，Patel, Ellie M,et al.MUC1 plays a role in tumor maintenance in aggressive thyroid carcinomas［J］.PMC，2007，27.
［10］Timothy JD, Nicholas FSW,et al.The role of MUC1 and MUC3 in the biology and prognosis of colorectal cancer［J］.World J Surg Oncol，2007，5: 31.
［11］Zucchi I, Mento E, Kuznetsov VA,et al.Gene expression profiles of epithelial cells microscopically isolated from a breast-invasive ductal carcinoma and a nodal metastasis［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2004，28:18147-18152.
［12］Grant A，Darnell, Toni M，et al.Inhibition of retinoblastoma protein degradation by interaction with the serpin plasminogen activator inhibitor 2 via a novel consensus motif［J］.Mol Cell Biol，2003，23:6520-6532.
［13］Stephanie L，Rellick,et al.Cellular pyrin domain-only protein 2 is a candidate regulator of inflammasome activation［J］.Infect Immun，2007，75:1484-1492.
作者单位：第二军医大学长海医院，上海长海路