纳米珍珠层粉的降解实验及其复合人工骨的生物相容性研究

【摘要】  ［目的］研究纳米珍珠层粉的体内降解情况，及其所制得的复合人工骨的生物相容性。［方法］机械研磨法制得的纳米珍珠层粉及其与消旋聚乳酸复合制得的人工骨，分别植入大鼠股骨骨洞及股部肌囊，同时与微米珍珠层粉及其人工骨作对照，并建立空白对照。于术后当天及第2、4、8周分别作X线片检查，动物处死前予四环素注射活体荧光标记，处死后行大体、组织学及扫描电镜观察。［结果］各检查结果显示纳米组较微米组降解更快，骨缺损愈合也最快；2种材料制得的复合人工骨均与周围组织结合良好。［结论］纳米珍珠层粉在动物体内的降解速度较微米级的快，可促进新生骨的生长；纳米珍珠层人工骨生物相容性好，是更好的生物活性可降解材料。

【关键词】  纳米颗粒； 珍珠层粉； 降解； 复合人工骨； 生物相容性

Research of the degradation of nanonacre powder and the biocompatibility of the nanonacre composite artificial bone∥TANG Yongzhi,CHEN Jianting,ZHAO Chengyi,et al.Department of Spinal and Orthopaedic Surgery,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China

    Abstract：［Objective］To study the degradation of nanonacre powder and the biocompatibility of the composite artificial bone made from this nanoscale powder in vivo.［Method］The nanonacre powder made through mechanical grinding and the artificial bones made from this powder and PDLLA (polyD,Llactide acid) were  implanted into the femoral holes and the femoral muscle sacs of rats respectively.Normal micronnacre powder and the artificial bones made from this powder and PDLLA were  implanted as control group,and blank group was set up without implanting anything.Xray photography was performed immediately and at 2,4 and 8 weeks after operation.The animals were injected with tetracycline for fluorescent mark before being killed.Then,the gross specimens,histological and SEM(scanning electron microscope) observations were performed.［Result］All the observations showed that nanonacre powder degraded faster than micronnacre powder,meanwhile,the bone defect recovery was the fastest in this group.Both of the composite artificial bones made from those two kinds of nacre powder had the good connection with the adjacent tissue.［Conclusion］The degradation of nanonacre powder is faster than that of micronnacre powder in vivo,and it  can promote the growing of new bone.Nanonacre composite artificial bone also has good biocompatibility.It is a kind of better bioactive degradable material.

    Key words：nanoparticle;  nacre powder;  degradation;  composite artificial bone;  biocompatibility

   珍珠层，作为一种具有诱导成骨活性和降解性能的生物材料，得到了广泛的研究。将微米级的珍珠层粉与消旋聚乳酸复合制成人工骨，经体内外实验研究，已证实其良好的骨诱导和骨传导作用。然而，其降解困难仍是目前所面临的一个主要问题。将珍珠层采用机械研磨的方法制作成纳米级的粉体，有望解决这一困难。现将这种纳米级珍珠层粉及其人工骨植入动物体内进行降解和生物相容性研究。

    1  材料与方法

    1.1   材料

    纳米级与微米级珍珠层粉均由广东海洋大学提供，由机械研磨法制得。消旋聚乳酸由惠州华阳医疗器械有限公司提供。复合人工骨由本实验室自行制备。将纳米级与微米级珍珠层粉分别与消旋聚乳酸复合，采用溶剂浇铸、热压铸模、溶质沥滤的步骤，制作出直径3.5 mm，厚1 mm的人工骨薄片。粉体及人工骨薄片均采用Co60辐照灭菌备用。

    1.2  实验动物分组

    SPF级SD雌性大鼠39只，体质量200～220 g，平均211 g，随机分组，2、4、8周3个处置时间点各13只，其中4只在双侧股骨骨洞及股部肌囊分别植入2种珍珠层粉体及人工骨薄片，另6只仅在双侧股骨骨洞植入2种珍珠层粉体，其余3只仅在双侧股骨钻洞，作为空白对照。

    1.3  手术方法 10％水合氯醛35 mg/kg麻醉。先于大鼠左大腿外侧切开进入，股骨髁上0.5 cm切开骨膜，2 mm钻头钻一骨洞，将纳米级珍珠层粉与生理盐水调和成面团状，注入骨洞内并压紧；在靠上方股外侧肌和股直肌间造肌囊，放入纳米级珍珠层人工骨薄片，逐层缝合伤口。采取同样方法于右侧骨洞和肌囊内分别植入微米级粉体和人工骨。仅在双侧骨洞植入2种粉体和只钻骨洞未植入粉体的大鼠，于取材前第10 d和第3 d分别行盐酸四环素30 mg/kg注射，进行活体荧光标记。

    1.4  观测内容

    1.4.1  动物术后反应  观察并记录动物的饮食、活动及切口愈合等情况。

    1.4.2  X线检查  于术后当天及第2、4、8周分别作X线片检查，曝光条件为60 kV，200 mA，25 mS，5 mAS，投照距离100 cm。

    1.4.3  大体标本、组织学及电镜观察  各时期大鼠处死后，行大体观察；截取其中2只植入材料大鼠股骨下段，植入人工骨薄片的肌囊取出，制作脱钙切片，HE染色观察；另2只植入材料大鼠股骨下段截取下来，经固定、干燥后，用利刀片将之在与骨洞垂直方向的骨纵轴面剖开，喷金后扫描电镜下观察；6只骨洞内植入粉体和3只空白对照的大鼠双侧股骨下段则采用甲酯包埋，制作硬组织磨片，荧光镜下观察，测新骨形成之双标四环素荧光条带间的距离。

    1.5  数据处理

    采用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计学处理，对植入纳米粉体、微米粉体及空白对照的3种骨洞区域的新骨生长速度进行比较，采用单向方差分析（One-Way ANOVA）。

    2  结  果

    2.1  动物术后反应

    术后无动物死亡，进食、饮水正常；活动量术后3 d恢复正常，无跛行；手术切口均达Ⅰ期愈合。

    2.2  X线检查

    　　术后当天可见植入粉体的骨洞区高密度影像，空白对照组则显示骨洞区低密度影。术后2周见原植入粉体处高密度影像消失，呈现透亮低密度影，植入纳米粉体部位更加明显，与此时空白对照组骨洞区低密度影相似。术后4周，各组均可见到骨洞新骨生长，低密度影向中央缩小，其中植入纳米粉体区缩小最甚。术后8周，各组骨洞区已愈合，与周围骨质无区别（图1）。

    2.3  大体标本观察

    　　各时期各组动物手术区及周围均未见炎症反应；2周时，双侧股骨髁上骨洞部分闭合，两侧均未见粉末残留，空白对照组则可见双侧凹陷之骨洞区；术后4周，双侧植入粉体之骨洞区已基本愈合，尚残留少许小凹痕迹，空白组双侧骨洞区也变浅；至8周时，各组动物股骨钻洞的骨缺损区已消失，恢复正常光滑骨表面。

    　　在各个观察点，双侧股部肌囊内所植入复合人工骨薄片形态如同植入初期，未发生明显变化，与周围肌组织连接紧密，有纤维组织牢固附着在材料上，未见炎症反应，包裹之肌纤维呈半透明状。

    2.4  组织学检查

    　　常规切片镜下可见：术后2周时，双侧植入粉体部位由于脱钙作用呈现为空白区，其周围已被大量的骨髓基质细胞包绕，并混杂有部分多核巨细胞和巨噬细胞以及红细胞，附近出现了编织骨和板层骨，相对而言，残存的纳米珍珠层粉要少于对侧的微米粉体；术后4周，2种粉体进一步吸收降解，纳米粉体的周围形成了大量的板层骨和部分网状骨，而微米粉体植入处则以板层骨为主；术后8周，2种粉体均已大部分降解吸收，增生板层骨消失，近骨皮质处形成了成熟的网状骨（图2）。

    　　2种人工骨薄片植入后不同时期切片，均发现与肌组织之间结合良好，无炎性细胞浸润，可见纤维组织长入人工骨组织内部，随着时间延长，血管化组织亦长入到人工骨内，显示出2种材料均具有良好的生物相容性。

    　　硬组织磨片荧光镜下观察，各组在不同时期，反应新骨生长速度的四环素荧光双条带间的距离及其与时间的比值（平均矿化沉积率），结果显示为纳米组＞微米组＞空白组，差异有统计学意义，P＜0.05（表1）。 表1  3组间四环素双标间距及平均矿化沉积率的比较注： 纳米组与微米组比较时， P＜0.05； 纳米组与空白组比较时， P＜0.01。

    图1  股骨粉体植入组（1a～1g）和空白对照组（1b～1h）不同时期X线片结果，箭头所指为植入粉体和钻骨洞部位，植入粉体左侧为纳米级、右侧为微米级。术后当天，可见植入粉体高密度影（1a）和骨洞低密度影（1b）；2周后，植入粉体大部分降解吸收，以纳米侧为甚（1c），空白对照骨洞也开始缩小（1d）；4周时，植入粉体消失，周围新骨生成，纳米侧更明显（1e），空白对照骨洞较前缩小（1f）；8周时，两侧植入粉体（1g）及空白对照（1h）的手术区域均已恢复到正常骨密度。图2  不同时期纳米珍珠层粉植入区（2a,2c,2e）和微米珍珠层粉植入区（2b,2d,2f）脱钙切片镜下所见（HE×100），星号表示为残留粉体部位。术后2周（2a,2b），4周（2c,2d），8周（2e,2f）。2.5  电镜观察

    　　在扫描电镜下，可见纳米珍珠层粉植入2周后，在骨洞区及周围广泛扩散开来，有编织骨和部分板层骨生成；植入4周，仍有少量粉体材料残留，骨洞区大量板层骨生成；8周后，板层骨消失，取而代之的是成熟的网状骨，几乎不见粉体材料残留。微米珍珠层粉在植入2周后，分布不甚均匀，显示扩散速度较慢，可见到编织骨和板层骨；植入4周，仍有不均匀粉体材料残留，可见板层骨生成；8周后，生成网状骨，其间仍可见到少量的微米珍珠层粉残存于此。

    3  讨  论

    3.1  纳米珍珠层粉在体内的降解

    　　植入材料在体内的生物降解，包括非特异性的理化溶解方式和活性细胞介导的吸收方式。影响理化溶解方式的因素，包括材料的形态大小和内部结构。有学者将整块的珍珠层材料植入动物体内松质骨区10个月后，仍保持着大小和形态的完整，而未出现明显降解的迹象，只与周围的骨形成了键合［1］，而将研磨成微米级的珍珠层粉植入体内时，则在体内出现了进行性的溶解和最终的降解，同时植入区出现血管化组织和新骨形成［2］。

    　　珍珠层的微细结构中，有机基质将无机的矿物质连接形成同一晶型方向的结构［3］，正是这种稳定结构阻碍了其降解。在作者的研究当中，将珍珠层通过机械方法研磨成纳米级的颗粒，此时珍珠层的文石型晶片结构已被瓦解，使得理化溶解方式容易进行，同时也使得其中具有生物活性的微量有机物质更好地释放出来。作者的研究结果已证实了纳米级的珍珠层粉较之微米级珍珠层粉降解更快，在电镜下见到植入的纳米粉体较微米粉体具有更好的分散效果，也支持了理化溶解的方式。

    　　细胞介导的吸收方式在珍珠层的降解当中仍是起作用的。在本研究中，组织切片观察发现在两周材料降解的高峰期，周围出现的巨噬细胞和多形核细胞，对材料的吞噬降解起到了一定的作用。然而，有研究发现，破骨细胞对珍珠层的降解作用则是有限的，这与珍珠层高钙的矿物成分有关，使得破骨细胞不能像降解骨组织一样对珍珠层起作用［4］。另一方面，珍珠层水溶性提取物虽然并不影响破骨细胞的粘附与成活，但却可抑制破骨细胞的活性，从而抑制了其吸收降解的功能［5］。

    　　由此作者推断珍珠层的降解主要是发生在理化溶解的方式上的。纳米珍珠层粉由于其小体积的特点，则更有利于这种降解的进行。本研究结果也证实了这点，同时发现在纳米珍珠层粉植入的部位，新生骨的生长速度更快，说明这一材料不仅易于降解，而且成骨的作用也增强了，这也印证了Webster等所得出的成骨细胞在纳米级材料上生长、增殖、分化比在常规材料更好的观点［6］。

    3.2  纳米珍珠层人工骨的生物相容性

    　　本课题组将珍珠层粉与另一种可降解生物材料——消旋聚乳酸复合成形，形成多孔的人工骨材料。在前期的研究中，采用的是普通微米级的珍珠层粉与消旋聚乳酸复合，珍珠层粉具有较好的亲水性，在局部形成微碱性环境，而消旋聚乳酸的水解产物是乳酸，为弱酸，两者起到了中和的作用，从而也增强了其生物相容性［7］。本研究中将纳米珍珠层粉与消旋聚乳酸复合而成的人工骨植入动物体内，并与普通微米级珍珠层人工骨作对照，两者具有相同的化学成分，且制备工艺相同，最终结果均表现出了良好的生物相容性。这就为纳米珍珠层人工骨的进一步应用研究打好了基础，今后作者将对这种复合材料的成骨和降解性能展开研究。

【参考文献】
  ［1］ Atlan G,Delattre O,Berland S, et al.Interface between bone and nacre implants in sheep［J］.Biomaterials,1999,11:1017-1022.

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［3］ Rousseau M,Lopez E,Stempfle P,et al.Multiscale structure of sheet nacre［J］.Biomaterials,2005,31:6254-6262.

［4］ Duplat D,Chabadel A,Gallet M,et al.The in vitro osteoclastic degradation of nacre［J］.Biomaterials,2007,12:2155-2162.

［5］ Duplat D,Gallet M,Berland S,et al.The effect of molecules in motherofpearl on the decrease in bone resorption through the inhibition of osteoclast cathepsin K［J］.Biomaterials,2007,32:4769-4778.

［6］ Webster TJ,Ergun C,Doremus RH,et al.Enhanced functions of osteoblasts on nanophase ceramics［J］.Biomaterials,2000,17:1803-1810.

［7］ 刘金标,陈建庭,金大地,等.珍珠层／聚乳酸组合人工骨体外相容性及降解实验研究［J］.第一军医大学学报,2003,2:130-132.

作者单位：南方医科大学南方医院脊柱骨病科，广东 广州