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【摘要】 ［目的］探讨耐药金黄色葡萄球菌注射剂量对新西兰大白兔胫骨慢性感染性骨缺损放射学和细菌学改变的影响。［方法］常规培养耐药金黄色葡萄球菌（ATCC 29213），倍比稀释至每5 μl中含6×101～6×106菌落总数（colony-forming units，CFU）。通过直接在兔胫骨近端制备骨窗后分别注射上述细菌5 μl制备兔胫骨慢性感染性骨缺损模型。对照组注射5 μl生理盐水。于术后3周行X线检查和细菌学检查。［结果］为了达到100%感染率，且出现明显的慢性骨髓炎模型的放射学和细菌学表现，至少需要注射6×105 CFU/5 μl。［结论］耐药金黄色葡萄球菌可诱导明显的胫骨感染性骨缺损形成，6×105 CFU/5 μl的剂量不仅可使慢性骨髓炎模型制备成功率达100%，而且能够出现较明显的放射学和细菌学改变。此外，模型制备中的各种参数可以应用于创伤后感染性骨缺损的评估。
【关键词】 骨缺损； 兔； 感染； 金黄色葡萄球菌
Relationship between inoculation dose and rabbit model of staphlococcus osteomyelitis∥TANG Hui，XU Yong-qing，ZHENG Tian-er，et al.Kunming General Hospital of Chengdu Military Command of Chinese PLA, Kunming 650032, China
Abstract: ［Objective］To investigate the relationship between inoculation dose of staphylococcus aureus versus radiological and microbiological changes of rabbit tibial infection with bone defect. ［Methods］Staphylococcus aureus(ATCC 29213) with total number of colony from 6×101 to 6×106 were prepared. The bacteria were injected in the tibia after an area of bone defect was made. The inoculated lesions were assessed for changes in radiological and bacteriological parameters at 3 weeks after infection.［Results］Development of significant histological and radiological signs of infected bone defect required an inoculum of at least 6×105 CFU/5 μl.［Conclusion］These results suggest that strain staphylococcus aureus (ATCC 29213) induces the development of chronic rabbit tibial infection with bone defect, and that this model may be applied to identification of virulence factors in studies of posttraumatic osteomyelitis.
Key words：bone defect； rabbit； infection； staphylococcus aureus
随着交通伤的频繁发生，开放性骨折日益增加，感染常合并骨缺损。迄今为止，感染性骨缺损的治疗仍是临床医师面临的一大难题［1］，尽管治疗方法多，但所需时间长［2］，因此其病理及诊治仍需进一步实验研究。对于慢性感染性骨缺损模型的制备，目前尚缺乏准确的细菌学研究。本实验通过研究注射不同菌量后发生的放射学、细菌学改变，探讨二者的关系，为兔胫骨耐药葡萄球菌感染性骨缺损模型的制备提供依据。
1 材料与方法
1.1 动物：选用6个月龄健康新西兰大白兔42只，体重2.25～2.60 kg，雌雄不限，昆明医学院实验动物中心提供。单独饲养，标准进食。
1.2 细菌来源及培养：耐药金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）来源于成都军区昆明总医院检验科。采用Mueller-Hinton（MH）培养基培养细菌，并将菌液浓度分别调整至1.2×101到1.2×106 CFU/μl，4℃保存。
1.3 动物实验过程及分组：兔称重后麻醉。常规消毒铺巾，切开皮肤暴露胫骨骨面，以3 mm克氏针钻孔制备0.5 cm×0.5 cm骨窗，注入5 μl鱼肝油酸钠和5 μl不同浓度的ATCC 29213，骨蜡封闭后缝合皮肤。对照组注入5 μl鱼肝油酸钠和5 μl生理盐水。实验兔依注射菌量不同随机分为7组，A组：6×101 CFU/5 μl；B组：6×102 CFU/5 μl；C组：6×103 CFU/5 μl；D组6×104 CFU/5 μl；E组：6×105 CFU/5 μl；F组：6×106 CFU/5 μl；对照组：5 μl生理盐水。术后3周处死所有实验兔。
1.4 检验指标：处死兔前称重，计算体重变化，行X线检查。处死后肉眼观察并行细菌学检查。兔放射学检查评估包括骨膜厚度（periosteal elevation,PE）、骨小梁结构变形（architectural deformation,AD）、骨干拓宽（widening of the bone shaft,WBS）、新骨形成（new bone formation,NBF）、软组织结构变形（soft-tissue deformation,STD）。每个参数评分为0～4分，分别计算每只实验兔的放射学参数总分。肉眼观察评分（gross bone pathological score, GBPS）包括0～4分，0分，无感染征象；1分，仅有少量红斑；2分，红斑合并胫骨干增粗及窦道形成，或合并浓液渗出；4分，严重骨质吸收、脓肿。无菌取骨后行细菌培养，计算每克标本中金葡菌数。放射学评分、肉眼观察评分采用双盲法。
1.5 统计学方法：应用SPSS 12.0统计软件分析，结果采用均数±标准差（x-±s）表示，组间体重减轻、大体评分以及放射学评分比较采用单因素方法分析。细菌计数比较先行对数转换,再行方差分析。
2 结果
2.1 体重改变：D、F组在术后因感染各死亡1只兔子。平均体重改变如表1示，对照组与A、B、C、D、E组均无明显差异，F组与其余各组之间有显著差异（P=0.027）（表1）。表1 各组兔体重改变组别数量（只）体重相对减少量
2.2 放射学检查：图1a示A组无明显感染，仅AD评分为0.17；B组PE和AD评分分别为0.5和0.75；C组大多数有轻微感染，PE和AD评分为1.25、1；D组PE、AD、WBS、STD均有改变，且评分在1～2之间；E、F组出现明显感染征象，评分在2～4之间；对照组没有出现感染征象（图1g）。图2对比每组不同参数，A组和对照组的各参数相差均不显著（P＞0.05），二者与其余组相差显著（P<0.01）；E、F组与C、D组相差显著（P<0.01）； C、D组PE、AD、NBF相差不显著（P＞0.05）；而在WBS、STD参数上相差显著（P<0.01）。对于参数总分而言，A组和对照组相差不显著，但与其他各组相差显著（P<0.01）；E、F组相差不显著（P＞0.05），二者与B、C、D组相差显著（P<0.01）；B组与C组相差显著（P<0.05）；与D组相差显著（P<0.01）；C、D组之间相差显著（P<0.01）（图2）。 图1a～g各组放射学检查 由D组起可见以骨质破坏、骨膜增厚和反应性骨质增生为主的慢性炎症表现。e、f组更明显。
D组是WBS、STD开始变化的最小剂量，E组所有参数均发生明显改变。
2.3 肉眼观察评分：对照组：0.0±0.0；A组：0.0±0.0；B组：0.25±0.1；C组：0.75±0.1；D组：1.25±0.2；E组：2.65±0.2；F组：3.0±0.0。对照组与A组相差不显著，二组与其他各组相差显著［B组（P<0.05），与其余各组P<0.01］；B组与C组相差显著（P<0.05），与D、E组相差显著（P<0.01）；E、F组相差不显著（P＞0.05）（如图3）。
C组开始出现变化，但从E组开始明显。
2.4 细菌学检查：各组检出细菌数如图4，对照组：3×10-4±0.00；A组：2.7×10-4±7×10-4；B组：0.32±0.07；C组：0.77±0.11；D组：1.45±0.25；E组：3.69±1.2；F组：3.8±0.78。对照组与A组相差不显著，二组与其他各组相差显著；B组与C组相差显著，P<0.05，与D、E、F组相差显著P<0.01；C、D组之间相差显著（P<0.05），二者与E、F组相差显著（P<0.01）；E、F组相差不显著。
E组细菌学改变明显高于对照组和A、B、C、D组，与F组相差不显著
3 讨论
开放性创伤往往合并骨缺损，并可能发展为骨感染，即使早期手术清创治疗，术后感染率也达到20%。这种感染性骨缺损的防治较单纯骨缺损更难，一期植骨非但不能促进骨缺损愈合，反而加重感染。因此，对于感染性骨缺损的治疗仍需深入的实验研究。
对于感染性骨缺损实验模型的构建，多数学者仍采用慢性骨髓炎模型，即钻孔后注入细菌。在感染方面，这种模型可一定程度模拟感染性骨缺损，但缺乏骨缺损的制备。有学者在慢性骨髓炎模型后期治疗时制造骨缺损，但骨缺损边缘污染轻，愈合快，不能很好地说明问题。因此，有学者开始采用在制备慢性骨髓炎模型的同时制造骨缺损［3］。对于这种结合骨缺损的慢性骨髓炎模型，目前尚缺乏细菌注射剂量与感染进程的关系研究，可能导致不能达到100%感染率，或因注射剂量过大而骨髓炎过于严重，甚至导致实验兔死亡。本实验就此进行了探讨。实验发现，如要出现明显的骨感染征象和细菌学阳性结果，至少需要注射6×105 CFU金黄色葡萄球菌。这一数据低于Schulz等人的研究结果［4］，这在一定程度上表明骨缺损增加了感染的程度，但二者之间的关系还有待进一步验证。由此进一步表明，伴有骨缺损的开放性骨折感染几率更大，更需要一期进行充分的清创。然而，本实验目的在于了解注射细菌总量对慢性感染性骨缺损造模的影响，其结果是否适用于急性感染性骨缺损尚需进一步研究。由于新西兰大白兔体形适中，价格便宜，且胫骨前仅有皮肤覆盖，手术操作方便［5］，因此实验选用兔作为骨感染研究的模型。
总之，对兔胫骨感染性骨缺损模型制备的研究表明，注射剂量达到6×105 CFU以上可出现明显的放射学和细菌学改变，适用于各种慢性感染性骨缺损研究中的模型制备，为慢性感染性骨缺损的诊治实验提供了研究基础。 图2各组放射学参数评分 图3各组肉眼观察评分 图4各组细菌计数
【参考文献】
［1］ 陈卫，丁真奇.感染性骨缺损的治疗及研究进展［J］.临床骨科杂志，2007，5：461-463.
［2］ 鲁玉来.全面看待慢性骨髓炎的治疗［J］.中国矫形外科杂志, 2008，11：872-874.
［3］ 袁志，胡蕴玉，雷伟，等.抗感染重组合异种骨对兔胫骨近端骨髓炎的预防作用［J］.中华外科杂志，2002，8：596-599.
［4］ Schulz S, Steinhart H, Mutters R. Chronic osteomyelitis in a new rabbit model［J］. J Invest Surg，2001,2:121-131.
［5］ An YH, Kang QK, Arciola CR. Animal models of osteomyelitis［J］. Int J Artif Organs，2006,4:407-420.
作者单位：成都军区昆明总医院附属骨科医院，云南省昆明市 650032