P物质在异氟烷诱发脊髓损伤大鼠神经源性肺水肿中的作用

【摘要】  ［目的］探讨吸入异氟烷的大鼠急性脊髓损伤后血清和肺泡灌洗液中P物质含量的改变与神经源性肺水肿的关系。［方法］成年雄性SD大鼠30只，体重300～330 g，随机分为1.5％异氟烷组、水合氯醛组和假手术组，每组10只。在T8水平球囊扩张造成脊髓压迫，压迫结束10 min后处死大鼠。检测各组大鼠血清和肺泡灌洗液中P物质含量和蛋白浓度，计算肺通透指数。［结果］1.5％异氟烷组大鼠血清和肺泡灌洗液中P物质高于水合氯醛组(P<0.05)，明显高于假手术组(P<0.01)；肺通透指数1.5％异氟烷组也高于水合氯醛组和假手术组(P<0.05)。水合氯醛组和假手术组的P物质及肺通透指数均没有明显差异(P>0.05)。［结论］1.5％异氟烷可能通过刺激P物质的大量释放参与急性脊髓损伤后肺水肿的形成过程。

【关键词】  脊髓损伤； 神经源性肺水肿； P物质； 异氟烷

Role of substance P in isofluraneprovoked neurogenic pulmonary edema in spinal cord injured rats∥ZHANG Shaobo,ZOU Zui,SHI Xueyin,et al. Department of Anesthesiolog, Changzheng Hospital, the Second Military Medical University, Shanghai 200003, China

    Abstract：［Objective］To  investigate  the  relationship  between neurogenic pulmonary edema (NPE) and the changes of substance P in serum and bronchoatveolar lavage fluid (BALF) in acute spinal cord injured rats during isoflurane inhalation.［Method］Thirty male SD rats with body weight of 300-330g were randomly divided into 3 groups: 1.5% isoflurane group,chloral hydrate group and sham operation group, ten in each group. Epidural balloon compression of the T8 spinal cord was performed. Alt animals were sacrificed 10 min after being compressed. The content of substance P and protein concentration in serum and BALF were measured. Then the lung permeability index (LPI) was calculated.［Result］The content of substance P in serum and BALF in 1.5% isofiurane group was higher  than that in chloral hydrate group (P<0.05) and significantly  higher  than that in sham operation group (P<0.01).LPI in 1.5% isoflurane group was also higher than that in chloral hydrate group and sham operation group (P<0.05). The content of substance P and LPI were not significantly different between chloral hydrate group and sham operation group (P>0.05). ［Conclusion］1.5% isofturane can stimulate the release of substance P to take part in the development of neurogenic pulmonary edema in rats.

    Key words：spinal cord injury;  neurogenic putmonary edema;  substance P;  isofturane

    神经源性肺水肿(neurogenic pulmonary edema，NPE)并不是脊髓损伤常见的呼吸系统并发症，但是它起病急骤，短时间内就会出现肺血管的闭塞，富含蛋白的水肿液渗出和肺泡内出血，进而影响患者的通气和换气功能。由于早期医生主要处理中枢神经系统损伤，而忽视了对NPE的及时诊断和合理治疗，因此病死率较高。作者在前期的研究中发现，使用1.5％异氟烷麻醉的大鼠急性脊髓损伤后肺水肿的发生速度快、严重程度高，可能与难以抑制交感神经的过度兴奋有关，但是单纯用“儿茶酚胺风暴”理论［1］来解释似乎无法说明水合氯醛组为什么没有明显的肺水肿。P物质(substance P，SP)是11个氨基酸组成的神经肽，广泛分布于神经系统和其他外周组织器官内，具有多种生理功能。P物质在外周的一个突出作用是使血管通透性增加和血浆蛋白外渗。异氟烷对呼吸系统的影响广泛而复杂，它可以增加肺泡上皮细胞和肺泡毛细血管膜的通透性［2］。那么吸入异氟烷会不会刺激感觉神经释放P物质，促进脊髓损伤(即spinal cord injury，SCI)后NPE的形成?本研究拟通过检测血清和肺泡灌洗液中SP的量并测定肺通透指数，探讨异氟烷诱发SCI后肺水肿的可能原因。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物及分组

    成年雄性SD大鼠30只，体重300～330 g，由中科院上海实验动物中心提供。大鼠随机分为3组：1.5％异氟烷组(isoflurane，Iso组)，吸入1.5％的异氟烷麻醉；水合氯醛组(chlorali hydras，CH组)用水合氯醛麻醉，大鼠吸入空气；对照组为假手术组(sham组)每组各10只。假手术组大鼠只暴露椎板不进行脊髓压迫。

    水合氯醛组大鼠用水合氯醛300 mg／kg腹腔注射；异氟烷组的大鼠放入自制的密闭有机玻璃容器内进行麻醉诱导，进气端接麻醉机，出气端接多功能气体监测仪。大鼠保持自主呼吸，调整异氟烷挥发罐至所需浓度，氧流量500 ml／min，容器内温度维持在(36±1)℃。待诱导结束达到平衡后大鼠经自制面罩吸入相应浓度的气体(流量500 ml／min)进行手术操作。

    1.2  动物模型的建立

    采用球囊充水脊髓压迫模型［3］。大鼠麻醉后常规消毒，在背部T10～L1水平作一个2cm的正中切口，向两侧分离背部肌肉，将T10椎板小心切除，保留硬膜，然后在大鼠硬膜外腔向头侧置入2FFogarty导管(Edwards Lifescience，USA)10 mm，到达T8、9水平。接一个压力注射泵，向球囊内快速注入相当于1.2大气压的蒸馏水5 min造成不完全损伤，然后放水取出导管，缝合软组织和皮肤。动物在取出导管后10 min处死。

    1.3  血清和肺泡灌洗液样本的制备

    实验结束后暴露大鼠腹腔，下腔静脉采血置于含抑肽酶40 μl的清洁试管，室温血液自然凝固15 min后离心(2 000 r/min，15 min，4℃)，取上清置于-70℃冰箱保存待测。沿胸骨剪断两侧肋骨，暴露胸腔，分离气管，取出肺脏，冰生理盐水双肺灌洗，每次5 ml，抽吸3次，共灌注3次15 ml。将灌洗液离心(2 000 r/min，15 min，4℃)，上清吸出置于-70℃冰箱保存待测。

    1.4  肺通透指数和P物质测定

    将制备好的血清和肺泡灌洗液上清按照BCA(Bicinchoninic acid)法(试剂盒由上海西唐生物公司提供)测定蛋白浓度，肺通透指数(lung permeability index，LPI)LPI=肺灌洗液蛋白浓度／血清蛋白浓度反映肺组织血管通透性的变化。采用双抗体夹心ABC-ELISA法(大鼠P物质ELISA试剂盒，美国ADI公司)测定血清和肺泡灌洗液上清P物质的含量。

    1.5  统计学分析

    应用SAS 9.1统计软件，对血清、肺泡灌洗液上清中的P物质，肺通透指数等计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用方差分析，方差不齐者用Kruskal-Wallis检验，P<0.05为差异有显著性统计学意义，P<0.01为差异有极显著性统计学意义。

    2  结  果

    各组动物在体重、体温方面差异均无统计学意义。三组大鼠血清和肺泡灌洗液(BALF)P物质浓度以及肺通透指数(LPI)的比较见（表1）。结果显示，1.5％异氟烷组(Iso组)血清和肺泡灌洗液中P物质的含量明显高于水合氯醛组(CH组)和假手术组(sham组)(P<0.01)，而CH、sham组P物质的量没有明显差别(P>0.05)；LPI提示Iso组比CH组和sham组通透性大(P<0.05)，CH、sham组的通透性没有明显差别(P>0.05)。表1  三组大鼠血清和BALF中P物质及LPI的比较 注：*与sham组比较，P<0.05；**与水合氯醛组比较，P<0.05。

    3  讨  论

    神经源性肺水肿起病急骤，短时间内就会影响患者的通气和换气功能。由于许多研究缺乏血流动力学指标，所以NPE的真实发病率仍然难以估计。但是从尸体解剖中发现脊髓损伤后的NPE其实并不少见［4］，它为中枢神经系统损伤后的肺部感染提供了一个易感环境，直接导致肺内氧弥散障碍，继而引起严重的低氧血症并可进一步发展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。

    有关NPE发病机制的研究目前公认的是“儿茶酚胺风暴”理论［5］，参与NPE形成的介质也有很多，如神经肽Y、一氧化氮、内皮素、兴奋性氨基酸、血管内皮生长因子［6］等。作者前期的实验结果也表明1.5％异氟烷不能有效抑制脊髓损伤过程中由于颅内压骤然增高导致的交感神经过度兴奋，但是水合氯醛麻醉的大鼠在脊髓压迫时血压较术前基础值也有明显的上升。单纯用“儿茶酚胺风暴”理论来解释似乎无法说明水合氯醛组为什么没有明显的肺水肿，再加上1.5％异氟烷组在10 min左右就出现肺水肿，远快于静脉麻醉药的作用［7］。因此，作者推测异氟烷本身对肺组织也有一定的影响。

    P物质在外周的一个突出作用就是使血管通透性增加和血浆蛋白外渗。各种伤害性刺激兴奋末梢感受器后，通过轴突反射和背根反射在末梢释放SP等神经肽。释放到局部组织的SP可促进肥大细胞脱颗粒释放组胺、激肽、趋化因子、前列腺素、白三烯、IL-1、IL-6、IL-8、IFN-Y等大量炎症介质，可促进单核细胞分泌IL-1、IL-6、TNF-Q等炎症因子，可延缓中性粒细胞凋亡，促进中性粒细胞黏附和移行，促进内皮细胞产生黏附分子，进一步加重组织炎症反应［8］。已经证实外源性给予SP和神经激肽A或者通过无髓鞘神经纤维(C纤维)释放的内源性SP都可以在哺乳动物气道产生多种反应，包括微血管通透性的增加，免疫细胞聚集和腺体分泌增加。那么P物质是否参与了脊髓损伤后的肺损伤过程，国内外至今还没有相关报道。

    在本实验中，Iso组血清和肺泡灌洗液的P物质含量均高于没有脊髓损伤的sham组，而且Iso组的LPI也明显高于sham组，说明健康大鼠吸入异氟烷并不会导致肺损伤。只有在脊髓损伤之后，交感神经活性的骤然升高造成了肺微血管内皮细胞和肺泡上皮细胞的损伤，感觉神经末梢得以暴露，在受到异氟烷的刺激之后，存在于感觉神经中的P物质大量释放，使血管通透性进一步增加，血浆蛋白外渗，加速了水肿形成并加重水肿程度。

    Iso组血清和肺泡灌洗液的P物质含量以及LPI也高于水合氯醛麻醉的CH组，而CH组的P物质含量和LPI虽然高于sham组，但是两组之间没有统计学差异。说明同等程度的脊髓损伤后，会引起感觉神经末梢释放P物质，但是静脉麻醉药水合氯醛不直接与肺泡表面接触，对感觉神经末梢的刺激作用轻微，因此P物质释放很少或者短时间内还没有释放。强大的血流冲击虽然可以造成内皮细胞和上皮细胞损伤，但是少量的P物质并不能发挥其增加血管通透性的作用，因此CH组的大鼠肺血管通透性低，血浆蛋白外渗少，在短时间内基本没有肺水肿的表现，延缓了肺的继发性损伤。   

    本实验也为SCI后出现ARDS提供了新的证据。急性脊髓损伤围手术期急性呼吸窘迫综合征的潜伏期一般为3～15 d左右［9］。随着病情的发展，缺氧症状并不因吸氧而明显改善，出现肺部感染、肺实变及水、电解质紊乱和酸碱平衡失调，如抢救不及时，死于呼吸衰竭。P物质除了增加血管通透性以外，它在炎症反应中也发挥着重要的作用。有实验表明P物质通过作用于其相应的受体在急性胰腺炎及其相关性肺损伤中起到了重要的促炎作用。本实验中，SCI大鼠的血清P物质增多，特别是吸入异氟烷的大鼠SCI后很短的时间内P物质的表达明显增多。因此可以推测，SCI后体内P物质大量释放，造成肺血管通透性增加和血浆蛋白外渗，促进了肺水肿的形成。同时P物质还促进单核巨噬细胞、肥大细胞释放大量的细胞因子和趋化因子，促进中性粒细胞黏附和移行，促进内皮细胞产生黏附分子，加重组织的炎症反应。作者前期的实验也表明平均动脉压在脊髓压迫时明显升高，而术后5 min反而低于术前基础值，说明血流冲击对肺组织的影响是一过性的，而P物质启动了炎症反应可能才是ARDS形成的主要原因。

    总之，单纯吸入1.5％异氟烷可以刺激SCI大鼠体内释放大量P物质，它可能参与了SCI后肺水肿的形成，并且可能通过其促炎作用，激活多种炎症因子，使肺损伤进一步恶化，甚至出现ARDS。因此，对于SCI患者，尽量避免单纯长时间吸入1.5％异氟烷，最好采用全凭静脉麻醉或静吸复合麻醉的方法，以免加重肺损伤，降低围手术期ARDS的发病率。   

【参考文献】
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［9］ 郑联合，马保安，王育才，等.急性脊髓损伤围手术期急性呼吸窘迫综合征的处理［J］.中国矫形外科杂志，2003,725-727.［10］Bhatia M,Slavin J,Cao Y, et al. PreprotachykininA gene deletion protects mice against acute pancreatitis and associated4ung injury［J］. Am J Physiol, 2003, 284:830-836.

作者单位：第二军医大学附属长征医院麻醉科，上海市 200003