胚胎干细胞分化为软骨细胞的研究现状与展望

【摘要】  胚胎干细胞具有多向分化潜能，在组织修复治疗方面具有广阔的应用前景。近年研究表明，胚胎干细胞在细胞因子、激素、微环境等作用下能够分化为软骨细胞。本文对近年来胚胎干细胞向软骨细胞定向分化中的各种因素进行综述。

【关键词】  胚胎干细胞； 软骨细胞； 分化

 Differentiation of embryonic stem cell into chondrocyte cell∥JIANG Bin,CHEN Honghui.Red Cross Hospital,Guangzhou 510220,China

    Abstract：Embryonic stem cell possess multidirectional differentiation capacity and can differentiate into all sorts of cells of three germ layers, it has the widely use in the treatment of tissue repair. Recent study shows that,embryonic stem cells can differentiate into cartilage cells in the effect of cytokines,hormones,microenvironment etc. In the is review,the author explore several studies and review the effects of different factors to the differentiation of embryonic stem cell to chondrocyte.

    Key words：embryonic stem cell;  chondrocyte;  differentionation

    关节软骨因损伤而导致衰退，甚至发生退行性关节炎。有近70％的65岁以上老年人受退行性关节炎的影响。由于没有神经和血管分布，软骨虽然有一定的自我修复能力，但是大于5 mm以上的局部软骨损伤就不能进行自我修复了，关节炎类软骨疾病一直不能得到很好的手术治疗。软骨组织的传统修复方法是自体组织分离的软骨细胞经体外培养，但是却面临着成熟软骨组织扩增能力有限，随着传代次数的增加，细胞逐渐老化而丧失增殖能力，难以满足组织构建需要和逐渐丧失其原有特性而分化成其他组织的问题。而胚胎干细胞(ES)和骨髓干细胞(MS)具有自我更新和多功能分化潜能的特性，在适当培养条件下可被诱导分化成软骨组织，其通过体细胞核转移技术(SCNT)有可能提供无免疫原性的“通用型”种子细胞，并同时排除伦理学问题，这将为软骨疾病的治疗提供大量的健康备用组织。相对MS细胞ES细胞有巨大的增殖潜力，显著的分化成为软骨细胞的能力和在体外能自发分化成为软骨或者骨细胞［1］，因此有理由认为胚胎干细胞在软骨组织工程中细胞来源是一个长远时期的最佳选择。

　　1  胚胎干细胞

    1.1  胚胎干细胞的概念

    1981年美国科学家Evans、Kaufman从小鼠胚胎中分离出胚胎干细胞并成功建系［2］，他们的研究被公认为最早的对胚胎干细胞进行的研究。  1998年Thomson、Gearhrt利用内细胞团和原始生殖细胞分别建立了人胚胎干细胞系，从此掀开了胚胎干细胞研究新的一页［3］。胚胎干细胞是一种高度未分化细胞，它具有发育全能性，可以分化为成体中所有的组织和器官。

    1.2  胚胎干细胞的生物学特性

    (1)全能性，体外培养的条件下，可分化为内、中、外3个原始胚层来源的全部细胞类型；(2)无限增殖性；(3)胚胎干细胞易于进行基因改造操作；(4)胚胎干细胞保留正常2倍体的性质且核型正常；(5)高端粒酶活性。有报道ES细胞培养1年，繁殖300代后仍具有高端粒酶活性。

    1.3  胚胎干细胞诱导分化为软骨细胞的过程

    胚胎干细胞逆软骨细胞诱导分化大致经历的过程：首先把胚胎干细胞消化成细胞悬液，使其摆脱滋养层细胞。在无黏性附性的悬浮液中生长，ES细胞就会发育成为类胚体(EBs)。然后类胚体在一些细胞因子、生长因子及化学物质的诱导条件下形成中胚层细胞，随后未分化的中胚层间充质细胞形成软骨祖细胞，软骨祖细胞经过化学趋化、聚集、增殖成为成软骨细胞(分为肥大和钙化软骨细胞)，最后成软骨细胞合成胞外基质最终分化成为软骨和骨。

    2  胚胎干细胞向软骨细胞定向分化的主要影响因素

    诱导胚胎干细胞向特定细胞分化是目前的难点。胚胎干细胞的研究主要集中在神经、血液和血管内皮等细胞的分化，而向软骨细胞分化的研究相对比较少，近年来ESC向软骨细胞转化方面的研究已经成为一个热点。而在胚胎干细胞向软骨细胞分化中外基质的组成、电荷性质、表面粗糙度以及几何构型都对软骨的生长有很大的影响，其主要影响因素有：

    2.1  细胞所处的培养环境

    体内机械条件在胚胎干细胞移植关节的软骨组织形态里面起着很重要的作用。不同的培养环境对软骨细胞的分化和纯度影响差别很大，相对来说3D环境更适合于软骨细胞的生长。到目前为止ES向软骨细胞分化已经在2D培养基、微团培养基、小球培养基中完成。而有相关研究将细胞包被在水凝胶［4，5］或薄的生物材料中再一次证明了3D环境更加适合软骨形成。最近Jukes JM［6］发现了一个更新、更好的4 mm厚的PEOT／PBT 3D混合共聚物软骨支架做为关节软骨修复的支架。除了这些外，体内的机械条件的改变也会对胚胎干细胞移植到软骨组织形态产生很大的影响。Nakajima M［7］用ES细胞对兔的髌骨软骨全层缺损进行移植，移植后将其分为关节活动组和关节固定组，在术后3周发现关节活动组形成了巨大的畸胎瘤。

    2.2  细胞因子及生长因子

    软骨细胞分化通过许多生长因子、细胞因子和分子信号进行调节。不同生长因子对产生软骨细胞的能力不同。Koay［8］在EBs细胞中添加TGF-D 3和BMP-2时产生具有高度胶原I型组织的纤维软骨结构，相反的TGF-β3+TGF-β1+IGF-I产生的组织结构不含I型胶原。而骨形成蛋白家族BMPs和SOX9在促进软骨分化和增殖中起着很重要的作用。Kramer研究中［9］发现了类胚体培养基中加入BMP2、BMP4，软骨小瘤的数量会增加。BMP2、4在软骨形成早期促进软骨细胞的增殖和成熟，维持软骨细胞的表型，还可以抑制软骨细胞的过度分化。Toh WS ［10］也证明了BMP2能提高软骨细胞的分化和影响EB细胞分化的方向。而在胚胎发育的过程中，软骨前体细胞以及软骨细胞都表达SOX9。体外ES细胞失去SOX9功能后导致分化软骨细胞缺陷［11］，而异位SOX9的表达可以使非软骨组织表达col-Ⅱ、SOX基因家族的另外两个成员L-SOX5、SOX6和SOX9联合作用可以成功诱导胚胎干细胞向软骨细胞分化，此诱导不受培养条件的影响，同时还抑制肥大细胞和造骨细胞的分化过程［12］；而白介素-1(IL-1)就通过降低SOX9和COL2a表达，从而抑制软骨分化［13］。Wnt蛋白家族在胚胎的发育和分化中起重要的作用。Derfoul等［14］通过基因转染使鼠胚胎间充质系C3HIOTl／2表达Wnt-3a，他们发现转染细胞表达高碱性磷酸酶活性，而且Wnt-3a能显著抑制其他成骨的标志基因如骨唾液蛋白、骨桥蛋白基因的表达。Smad基因家族是新进发现的一个重要的新基因家族。TGF-β转化生长因子对软骨细胞分化有重要的诱导作用，而Smad通过影响TOF-β以达到调控软骨细胞分化的作用。Runx2家族主要在骨软骨形成中发挥作用，是软骨细胞与造骨细胞分化晚期的一个潜在的诱导者［15］。Runx2通过维持启动早期软骨细胞分化来促进软骨发生。除此以外，成纤维细胞生长因子(FGF)家族以及胰岛素样生长因子(IGF)［16］家族也有诱导ES向骨组织分化的能力。而Greco SJ［17］最新发现胚胎转录因子OCT4在ESCs中促进ESCs特殊基因型的表达和调节ESCs细胞分裂周期。

    2.3  其他诱导物在软骨发生中的诱导作用

    其他诱导物如地塞米松、甲状腺素、前列腺素E2和抗坏血酸等也被证实可引发软骨形成。Vc被证实是体外培养细胞合成胶原的必备物质，并能调节ATP酶活性及蛋白的合成。  β-磷酸甘油作为碱性磷酸酶的底物，可为成骨细胞提供磷离子。1，25-二羟β3也能引发软骨形成［18］。还有研究证实，在含有牛血清(FCS)的培养液中，ES细胞就能分化为软骨细胞，而不用添加任何特殊的生长因子。而Zur Nieden［19］研究发现，视黄酸(retinoicacid)加上TGF β-3和甲状旁腺可以增加成软骨化。与细胞因子及生长因子类诱导物相比，化学诱导物的成分确定，作用也更为稳定，可以持续几天至几周，其对软骨细胞分化的作用也是至关重要的。另外还有些胞外基质如粘多糖、透明质酸、硫酸软骨素等通过介导细胞间的相互作用，从而促进软骨细胞的分化和成熟。

    3  中药有效成份促进软骨细胞分化的作用

    除了上述细胞因子、生长因子等诱导物外，许多中医中药的有效成份在促进软骨细胞分化的过程中也发挥着一定的作用。国内曾经报道补肾健骨汤能够减少关节滑液分泌，在软骨破坏区出现大量幼稚软骨细胞，确有修复软骨作用。也有学者发现中药软骨细胞的增殖有显著的促进作用［20］。如六味地黄汤、补肾方汤、鹿茸多肽等。近年来，国内外学者十分重视从植物中提取和筛选天然有效成份用于干细胞的研究，大量实验表明淫羊藿有效成份能促进骨髓基质干细胞的增殖并出现成骨性分化。有研究表明通过对成骨细胞株MC3T3-E1促进骨形成的体外实验，发现Ica是通过上调Runx的表达、产生BMP-2，BMP-4以激活BMP系统从而产生成骨的功效［21，22］，大量临床实验研究也证实淫羊藿有效成份EPFs能防止绝经后妇女的骨丢失［23］。

    4  胚胎干细胞向软骨细胞定向诱导分化的研究前景

    正是由于ES具有良好的组织分化潜能和高增殖活性，获取方法相对简易，便于自体移植，故在组织工程领域展现了其良好的应用前景。但就是软骨组织工程来说其应用到临床上还面临许多问题没有解决。其主要存在的问题有：（1)胚胎干细胞的来源困难，从小鼠胚胎干细胞建系效率来看，获得一个干细胞系需要12个囊胚和更多的卵细胞(平均666个)移植时产生免疫排斥；（2)移植后形成畸胎瘤；（3)胚胎干细胞的最佳培养条件；（4)遗传的不稳定性；（5)多代培养产生染色体异常。但是ES细胞作为理想的种子细胞，尽管现阶段还有很多问题亟待解决，其在骨软骨组织损伤和缺失的修复重建中具有广阔的潜力和前景。

【参考文献】
  ［1］ Kramer J，Bshrnsen F，Schlenke P，et al．Stem cellderived chondrocytes for regenerative medicine［J］.Transplant Proc, 2006, 3:762-765.

［2］ Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential ceils from mouse embryos［J］.Nature, 1981,292:154-156.

［3］ Thomson JA, Itskovitz EJ, Shapiro SS, et al. Embryonics rem cell line derived from human bias tocysts［J］.Science,1998,5391:1145-1147.

［4］ Hwang NS, Varghese S, Zhang Z, et al. Chondrogenie differentiation of human embryonic stem cellderived ceils in arginineglycineaspartatemodified hydrogels［J］.Tissue Eng,2006,9:2695-706.

［5］ Hwang NS, Kim MS, Sampattawmich S, et al. The effects of three dimensiona culture and growth factors on the chondrogenic differentiation of murine embryonic stem ceils［J］. Stem Cells, 2006,2:284-291.

［6］ Jukes JM, Moroni L, van Blitterswijk CA, et al. Critical steps toward a tissueengineered cartilage implant using embryonic stem cells［J］. Tissue Eng Part A, 2008, 1:135-147.

［7］ Nakajima M, Wakitani S, Harada Y, et al. In vivo mechanical condition plays an important role for appearance of cartilage tissue in ES cell transplanted joint［J］.J Orthop Res, 2008, 1:10-17.

［8］ Koay EJ, Hoben GM, Athanasiou KA. Tissue engineering with chondrogenically differentiated human embryonic stem cells［J］. Stem Cells, 2007, 9:2183-2190.

［9］ Kramer J, Hegert C, Guan K, et al. Embryonic stem cellderived chondrogenic differentiation in vitro:activation by BMP-2 and BMP-4［J］.Mech Dev, 2000,2:193-205.

［10］Toh WS, Yang Z, Liu H, et al. Effects of culture conditions and bone morphogenetic protein 2 on extent of chondrogenesis from human embryonic stem cells［J］. Stem Cells, 2007,4:950-960.

［11］Hargus G, Kist R, Kramer J, et al. Loss of Sox9 function results in defective chondrocyte differentiation of mouse embryonic stem cells in vitro［J］.Int J Dev Biol, 2008,4:323-332.

［12］Ikeda T, Kamekura S, Mabuchi A, et al. The combinaiton of SOX5, SOX6 and SOX9 (the SOX trio) provides signals sufficient for induction of permanent cartilage［J］.Arthritis Rheum, 2004,50:3561-3573.

［13］Majumdar MK, Wang E, Morris EA. BMP-2 and BMP-9 promotes chondrogenic differentiation of human multipotential mesenchymal cells and overcomes the inhibitory effect of IL-1［J］. J Cell Physiol, 2001,224:69-78.

［14］Derfoul A, Carlberg AL. Differential regulation of osteoggenic marker gene expression by Wnt3a in embryonic mesenchymal multipotential progenitor cells［J］.Differentiation, 2004,72:209-223.

［15］Smith N, Dong Y, Lian JB, et al. Overlapping expression of Runxl(Cbfa2) And Runx2(Cbfal) transcription factors supports cooperative induction of skeletal development［J］.J Cell Physiol, 2005,203:133-143.

［16］Heng BC, Cao T, Lee EH. Directing stem cell differentiation into the chondrogenic lineage in vitro［J］.Stem Cells, 2004,7:1152-1167.

［17］Greco SJ, Liu K, Rameshwar P. Functional similarities among genes regulated by OCT4 in human mesenchymal and embryonic stem cells［J］. Stem Cells, 2007, 12:3143-3154.

［18］Nicole I, Ahr HJ. In vitro differentiation of embryonic stem cells into mineralized osteoblasts［J］.Differentiation, 2003,71:18-27.

［19］Zur Nieden, Kempka G, Rancourt DE, et al.Induction of chondro, osteo and adipogenesis in embryonic stem cells by bone morphogenetic protein-2: effect of cofactors on differentiating lineages［J］. BMC Der Biol,2005,5:1.

［20］Guo BL, Xiao PG. Comment on main species of herba epimedii［J］. China J Chin Mater Med, 2003,4:303-307.

［21］Zhao J, Ohba S, Shinkai M, et al. Ieariin induces osteogenic differentiation in vitro in a BMPand Runx 2dependent manner［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2008,2:444-448.

［22］Yin XX, Chen ZQ, Liu ZJ, et al. Icariine stimulates proliferation and differentiation of human osteoblasts by increasing production of bone morphogenetic protein 2［J］. Chin Med J (Engl), 2007,3:204-210.

［23］Zhang G, Qin L, Shi Y. Epimediumderived phytoestrogen flavonoids exert beneficial effect on preventing bone loss in late postmenopausal women: a 24month randomized, doubleblind and placebocontrolled trial［J］. J Bone Miner Res, 2007, 7:1072-1079.

作者单位：广州市红十字会医院，广州市海株区同福中路396号 510220