膝关节退行性骨关节炎钙化层病理改变研究

【摘要】  ［目的］对骨性关节炎软骨钙化层病理结构进行形态学分析，为临床诊治及预防相关疾病提供理论依据。［方法］标本均来源于临床诊断为膝关节退行性骨关节炎患者，共21例，其中，男1例，女20例。股骨髁负重区取材、修剪、固定后，常规制备石蜡切片，番红O／固绿染色，显微镜观察。［结果］本研究收集的标本平均年龄（65. 57±7. 43）岁；平均身高（155. 38±5. 32）cm；体均体重（59. 95±8. 99）kg；平均病程（13. 04±9. 66）年。番红O／固绿染色示钙化层病理改变主要为潮线复制、漂移，出现多条潮线结构，钙化层结构明显增厚，最厚处为900多微米；钙化层增厚伴血管长入；非钙化软骨及钙化层纤维样改变；潮线间隙增宽；钙化层及深层软骨缺损。［结论］膝关节退行性骨关节炎钙化层形态结构具有特异性的病理改变。

【关键词】  骨性关节炎； 钙化层； 病理学改变； 组织染色

Study on the pathology shape structure of calcified cartiage zone in osteoarthritis knee joint∥WANG huawei,YANG Liu,WANG Fuyou,et al.Center for Joint Surgery,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China

    Abstract：［Objective］Study on the Pathology shape structure of calcified cartilage   one in Osteoarthritis knee joint and provide the theory for diagnosis and treatment of  correlated disease.［Method］Osteoarthritis condyles of femur (n=21) were collected from  knee joint replacement and the paraffin sections were prepared after fixation and  decalcification.After stained with Safranin O/fast green, the shape structure of  calcified cartilage zone was observed by microscope.［Result］Mean age of osteoarthritis  patient was 65.57±7.43 yearsold;mean stature was (155.38+5.32)cm; mean weight was (59.95 ±8.99)kg;mean pathogenesis was (13.04±9.66) years.After stained with Safranin O/fast  green,the pathological changes of calcified cartilage zone were defined as follow.Tidemark drift and thickening accompany with blood vessel invasion.The gap of tidemark  increased width.Calcified cartilage zone desmoid changed or defect.［Conclusion］Calcified cartilage zone in Osteoarthritis knee joint taken place specific pathological  changes.

    Key words：osteoarthritis;     calcified cartilage zone;     pathological changes;     tissue staining

   骨性关节炎(osteoarthritis,OA)，亦称退行性骨关节病，是一个以关节软骨退行性改变为核心，累及骨质并包括滑膜、关节囊及关节其它结构的慢性炎症；是一种无菌性、慢性、进行性侵犯关节，特别是负重关节的疾病。表现为关节软骨破坏，关节表面形成骨赘，滑膜细胞增生，滑膜炎和关节间隙变窄。骨性关节炎从关节软骨起病，影响整个关节结构，包括软骨下骨、韧带、滑膜、关节囊，关节功能障碍，严重降低了中老年人的生活质量，且增加了患者的医疗费用，因而备受重视。近年来，骨性关节炎所导致的疼痛、关节炎的病因学和发病机制的研究已渐深入。临床上OA可以分为原发性和继发性，后者引起软骨退行性变的直接原因为结构改变、炎性、代谢等；原发性OA的原因不太清楚、只能提出一些看法，如各种各样的遗传因素、环境因素等，特别是老化过程、正常的磨损、慢性损伤、肥胖、饮食等都可能是发病因素。临床上以膝关节发病最常见，也最具代表性。表现为关节软骨生化代谢异常和结构损害、软骨局部结构损伤合并软骨组织变性、滑膜炎性变、关节囊纤维增生，最终导致膝关节疼痛、肿胀、功能障碍，甚者致残疾。OA在老年人中发病率较高，极大危害老年人健康，严重影响老年人生活质量。针对OA目前缺乏确切诊断依据，本课题组在前期研究工作中，对钙化层的正常形态结构进行了研究，但目前对于骨关节疾病中钙化层病理结构改变尚缺乏深入了解。本研究以膝关节发生退行性骨关节炎的股骨髁为实验对象，采用病理切片、番红O／同绿染色等对软骨、骨组织进行特异性染色方法[2]，对钙化层病理结构进行形态学分析，为临床诊治及预防相关疾病提供理论依据。

    1     材料与方法

    1.   1     实验材料

    1.   1.   1     标本来源及例数     所选标本均来源于临床诊断为膝关节退行性骨关节炎，并进行膝关节置换的患者。由第三军医大学西南医院关节外科提供。

    膝骨关节炎诊断标准[1]，临床症状：(1)前几个月大多数日子膝痛;(2)关节活动时有骨响声；(3)晨僵<30 min;(4)年龄≥38岁；(5)膝检查示骨性肥大。膝骨关节炎存在：具备(1)，(2)，(3)，(4)或(1)，(2)，(5)或(1)，(4)，(5)项。临床及放射学：(1)前个月大多数日子膝痛；(2)X线示关节边缘骨赘；(3)关节炎实验室检查符合骨关节炎；(4)年龄≥40岁；(5)晨僵<30 min；(6)关节活动时有骨响声。膝骨性关节炎存在：具备(1)，(2)或(1)，(3)，(5)，(6)或(1)，(4)，(5)，(6)项。

    1.   2     主要试剂和配制方法

    1.   2.   1     标本固定与脱钙

    (1)固定液：10％甲醛固定液；

    (2)Jenkins混合酸脱钙液：浓盐酸4 ml，冰醋酸3 ml，氯仿10 ml，纯乙醇73 ml，蒸馏水10 ml。

    1.   2.   2     番红O／固绿染色     (1)0.   02％固绿水溶液：固绿(Fast green)(Sigma公司，美国)0.   02 g，蒸馏水100 ml;(2)0.   1％番红水溶液：番红O染粉(Safranin O)(Sigma公司，美国)0.   1 g，蒸馏水100 ml;(3)1％盐酸酒精分化液：浓HCl 1份，95％乙醇99份。

    1.   3     实验方法

    1.   3.   1     组织切片制备     取股骨髁负重区骨软骨标本6例，10％甲醛固定液固定24 h，Jenkins混合酸脱钙液脱钙24 h，常规石蜡包埋，然后进行纵切片，片厚5 μm。

    1.   3.   2     番红O/固绿染色[2]         (1)石蜡切片脱蜡至水；(2)苏木素染细胞核1～3 min，显微镜观察视染色情况决定染色时间的长短；(3)自来水充分洗涤，去除残留苏木素；(4)1％盐酸酒精分化15～30 s，分化时间视颜色深浅而定；(5)自来水充分洗涤，去除残留染液；(6)0.   02％固绿水溶液染色3 min，固绿是一种酸性染料，呈碱性细胞质或细胞外基质-绿色；(7)1％冰醋酸洗涤切片，去除残留固绿；(8)1％番红O 3 min，番红是一种碱性染料，呈酸性细胞质或细胞外基质-橙黄／红色；(9)95％乙醇浸洗，洗去残留番红；(10)95％乙醇、无水乙醇脱水；(11)二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。

    2     结     果

    2.   1     病例资料统计

    所选标本均来源于临床诊断为膝关节退行性骨关节炎，并进行膝关节置换的患者。其中男1例，女20例；左膝9例、右膝12例；平均（65.   57±7.   43）岁（52～ 78岁）；平均身高（155.   38±+5.   32）cm(150～ 167 cm);平均体重（59.   95±8.   99）kg（45～ 73 kg）;平均病程（13.   04±9.   66）年（1～ 30年）。

    2.   2     番红O/固绿染色观察

    正常骨软骨石蜡切片番红O／固绿染色，200倍镜下观察可见软骨呈红色，软骨下骨呈蓝色。纵切片上软骨中下部可见黑染的波浪状线性结构，即为潮线；潮线以上为透明软骨，潮线以下红染区域为钙化软骨，即钙化层；钙化层底部以凸凹不平的梳齿状结构与蓝染的软骨下骨相互锚合，界限明显，其交界处为粘合线。钙化软骨位于潮线与粘合线之间，齿梳样结构，最厚处为300多微米；最薄处为几微米；其结构较为致密，内可见少量的肥大软骨细胞分布于潮线附近(图1a)。

    骨性关节炎骨软骨石蜡切片中可见以下几种病理改变：(1)潮线复制、漂移，出现多条潮线结构，钙化层结构明显增厚，最厚处为900多微米(图1b)；(2)钙化层增厚伴血管长入(图2a)；(3)非钙化软骨及钙化层纤维样改变(图2b)；(4)潮线间隙增宽(图3a)；(5)钙化层及深层软骨缺损(图3b)。

    钙化软骨层的形成过程：骨骼发育成熟后，关节端自关节面向深部可分为透明软骨层、钙化软骨层和软骨下骨三层结构。骨骼发育成熟之前，关节软骨具有两层软骨细胞增殖区，近关节面浅层增殖区的软骨细胞分裂、增殖，扩大关节端软骨范围；深层增殖区的软骨细胞则以软骨内成骨方式形成干骺端软骨下骨，此过程中细胞外基质钙盐的沉积与吸收处于平衡状态。骨骼发育成熟，大约17～20岁以后，近关节面浅层增殖区的软骨细胞停止生长性增殖，发育成海绵状透明软骨层包绕关节面；深层增殖区的软骨内成骨过程也随之停止，此时细胞外基质沉积的钙盐不再被溶解吸收，从而发育形成钙化层结构[3，4]。

    钙化软骨层的功能：关节软骨为覆盖关节面的海绵状透明软骨，具有良好弹性，能承受关节运动时瞬间产生的巨大负荷。以髋关节为例，病变步行其载荷为体重的3倍，而剧烈运动时其载荷为体重的8倍[5，6]。除抗压外，关节软骨还具有吸收震荡、传导分散应力等生物学特性，从而保护关节及其附属器官不会因为承受瞬间的巨大冲击而受损。关节软骨的这种力学特性与钙化层结构的存在密切相关。在关节骨软骨复合组织中，钙化层结构具有重要的生物学功能。钙化层通过其上界面波浪状潮线结构与透明软骨层紧密嵌合，通过其下界面凸凹不平的梳齿状结构与软骨下骨密切锚合，这种特殊的界面连接方式不仅极大地增加了各层组织界面之间的连接面积，同时也增加了界面之间的连接强度；不但可以将关节软骨牢牢地固定在软骨下骨上，而且还有利于来自于软骨的瞬间应力向软骨下骨传导分散。此外，致密的钙化层结构阻止了髓腔内的液体及小分子有机物质进入软骨非钙化层，从而维持软骨及软骨下骨特殊的生理微环境的稳定。完整的钙化层结构对于维持关节透明软骨的存活及其功能发挥具有重要意义。钙化层结构一旦遭到破坏，透明软骨的生理微环境就会受到影响，近而导致透明软骨向纤维软骨发生改变，此机制就是为什么采用微骨折手术治疗软骨缺损不能形成真正透明软骨的重要原因[7]。

    关节软骨钙化层的病理改变：为了深入了解关节软骨钙化层的病理改变，本研究选用骨性关节炎最具代表性的膝关节为研究对象，采用病理切片、番红O／固绿染色等软骨、骨组织进行特异性染色方法[8]，对钙化层病理结构进行形态学分析。所选标本均来源于临床诊断为膝关节退行性骨关节炎，并进行膝关节置换的患者。由第三军医大学西南医院关节外科提供。取材部位为股骨髁负重区。番红O／固绿染色方法应用，结果表明骨性关节炎的病理改变主要有以下几种类型：潮线复制、漂移，出现多条潮线结构，钙化层结构明显增厚，最厚处为900多微米；(1)钙化层增厚伴血管长入；(2)非钙化软骨及钙化层纤维样改变；(3)潮线间隙增宽；(4)钙化层及深层软骨缺损。番红O／固绿染色可见软骨表层出现浅表溃疡，软骨中深层基质部分沿其胶原纤维走向撕裂，形成较多与表面垂直的裂隙，呈“微纤化”表现。细胞大小不等，有的成簇状，轮廓欠清晰，部分细胞坏死[9]。软骨厚度明显减少，潮线前移、紊乱，部分消失，钙化层增厚，血管自软骨下骨长入软骨钙化层或软骨深层。为关节骨软骨相关疾病的诊断提供可靠病理结果具有重要的临床意义。

【参考文献】
  ［1］ 徐卫东，吴岳富，张春才，主编.骨关节的诊断与治疗（第2版）［M］．上海：第二军医大学出版社，2004，3-4.

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［3］ Kume S,Ato S,Yamagishi S,et al.Advanced glycation endproducts attenuate human mesenchymal stem cells and prevent cognate differentiation into adipose tissue,cartilage,and bone[J].J Bone Miner Res，2005,9:1647-1658.

［4］ Daubs BM，Markel MD，Manley PA.Histomorphometric analysis of articular cartilage,zone of calcified cartilage,and subchondral bone plate in femoral heads from clinically normal dogs and dogs with moderate or severe osteoarthritis[J].Am J Vet Res，2006,10:1719-1724.

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［8］ 龚志锦，詹镕洲，编著.病理组织制片和染色技术[M].上海：上海技术出版社，1994，269-272.

［9］ Mano JF,Reis RL.Osteochondral defects:present situation and tissue engineering approaches[J].J Tissue Eng Regen,2007,4:261-73.

作者单位：第三军医大学西南医院关节外科中心，重庆 400038