rh-BMP-2壳聚糖微球的制备及体外检测

【摘要】  [目的]以壳聚糖为辅料，通过乳化交联法制备新型重组人骨形态发生蛋白-2缓释微球，并对其粒径、载药、体外释药、理化特性及降解特性进行检测，以评估应用生物可降解的壳聚糖微球作为BMP-2缓释载体的可行性。[方法]以京尼平作为交联剂，应用乳化交联法制备具有控制释放功能的负载rhBMP-2壳聚糖微球，应用扫描电镜观察微球的形态和粒径;利用酶联免疫吸附实验(ELISA)动态检测BMP-2壳聚糖微球的载药率、包封率和缓释规律以分析微球的缓释能力。[结果]乳化交联法制备的壳聚糖微球，球形良好，球体表面光滑，具有较高的包封率(>85%)。体外药物释放试验表明，rhBMP-2可以从壳聚糖微球中缓慢释放，整个释放过程可达30 d。[结论]应用乳化交联法制备的负载rhBMP-2壳聚糖缓释微球，具有很好的控制释放rhBMP-2的能力。这种新型药物控制释放系统在细胞因子的控制释放及骨组织工程中有潜在的应用价值。

【关键词】  重组人骨形态发生蛋-2; 壳聚糖; 微球; 成骨; 京尼平

Preparation of rh-BMP-2 loaded chitosan microsphere and its properties in vitro∥HUANG Xin，MENG Guo-lin, LIU Jian，et al.Institute of Orthopaedics, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University，Xi’an 710032, China

　　Abstract: To prepare and characterize a novel controlled release system for rhBMP-2 and to evaluate the feasibility of chitosan microsphere as a carrier for controlled release of rhBMP-2. The rhBMP-2 loaded chitosan microsphere was prepared using an emulsion cross-linking method with genipin as the cross-linking agent. Scanning electron microscopy was used to evaluate the morphological properties and particle size distribution. An ELISA assay was adopted to determine the actual drug loading and in vitro drug release kinetics.The rhBMP-2 loaded chitosan microspheres were spherical in shape, and showed a smooth surface and a high encapsulation efficiency (>85%). From the in vitro release experiment, the rhBMP-2 was controlled to release from the chitosan microsphere over 30 days.The rhBMP-2 loaded chitosan microsphere prepared by emulsion cross-linking method shows a good controlled release property. Such a novel type of controlled release system has the potential of being applied for controlled cytokine delivery and the bone tissue engineering.

　　Key words：rhBMP-2; chitosan; microsphere; bone formation; genipin

　　重组人骨形态发生蛋白-2(recombinant human bone morphogenetic protein-2，rhBMP-2)是转化生长因子超家族的一员，具有广泛的生物学活性。研究结果表明，外源性rhBMP-2具有强大的骨诱导活性，因此，rhBMP-2在骨组织工程中具有重要意义[1～3]，然而rhBMP-2的体内半衰期短，全身和局部应用很快被稀释代谢，达不到所期望的生物效果，因此，研究rhBMP-2的缓释方法具有重要的理论和实际应用价值[4、5]。本实验采用乳化交联法制备rhBMP-2壳聚糖载药微球，制备出粒径适宜的缓释微球，并对所制备微球的理化特性进行研究。

　　1 材料和方法

　　1.1 rhBMP-2壳聚糖微球的制备

　　采用乳化交联法制备rhBMP-2壳聚糖微球，参照文献[6]的方法并加以改进。具体方法：壳聚糖(Sigma，CA，USA)150 mg溶于20 ml/L乙酸溶液9 ml中，与①20 ml/L乙酸溶液1 ml(对照组);或②rhBMP-2(Sigma，CA，USA)100 μg溶于4mmol/L HCl溶液1 ml混合，混合液缓慢加入含5 ml Span-80的辛醇溶液90 ml中，磁力搅拌器搅拌2 h，加入1 ml京尼平(2%，Challenge Bioproducts Co.，Taichung，Taiwan)交联，继续搅拌40 min，沉淀，异丙醇，石油醚，双蒸水反复漂洗，分别制备出空白壳聚糖微球及rhBMP-21壳聚糖微球。

　　1.2 微球的形态和粒径分析

　　用冷冻干燥仪冷冻干燥所得rhBMP-2壳聚糖微球，将干态微球均匀散在样品平台上，用导电胶固定后，临界点干燥后离子溅射喷金，用扫描电镜(S-3400N，HITACHI，Tokyo，Japan)观察微球表面形态，在扫描电镜下，随机计数500个微球的直径，获得粒径分布特征的相关信息。

　　1.3 微球载药量，包封率测定

　　壳聚糖微球吸附rhBMP-2的操作均在4℃下进行，以保持rhBMP-2的活性。由于rhBMP-2的含量为ng数量级，应用传统的方法难以定量，因此，采用具有较高灵敏度的ELISA方法(Santa Cruz，CA，USA)检测剩余rhBMP-2从而推断rhBMP-2壳聚糖微球的载药率和包封率。具体方法如下：10 mg rhBMP-2壳聚糖微球溶解于20 ml/L乙酸溶液2 ml中，磁力搅拌至完全溶解。在96孔板内加入上述溶液及不同浓度的标准液各100 μl室温(18℃～25℃)孵育1 h洗板3次，每孔中加入辣根过氧化物酶标记的抗体50 μl室温(18℃～25℃)振荡孵育4 h洗板3次，每孔各加底物100 μl，室温(18～25℃)避光振荡孵育15 min，每孔各加终止液100 μl混匀，450 nm处检测吸光度(A)值，计算载药量和包封率。

　　1.4 rhBMP-2壳聚糖微球的降解

　　取5 ml试管27支，每支试管中置入60 mg空白壳聚糖微球(共3支)，各加入含107 U/L溶菌酶的磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH7.4)2 ml，37℃水浴振荡[11]，取每支试管中不同时间段(每隔3 d)，将其内微球冷冻干燥称重。根据称量结果绘制壳聚糖微球降解曲线，研究壳聚糖微球的降解规律。

　　1.5 体外rhBMP-2释放检测

　　取5 ml试管3支，每支试管中置入60 mg rhBMP-2壳聚糖微球(共3支)，各加入含107 U/L溶菌酶的磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH7.4)2 m1，37℃水浴振荡[11]，取每支试管中不同时间段(每隔3 d)上清液100 μl，用检测人rhBMP-2的ELISA检测试剂盒检测，具体操作方法同上，计算均值，根据ELISA的结果，绘制BMP-2壳聚糖微球的累计释放曲线。

　　2 结果

　　2.1 微球的形态及粒度分析

　　应用扫描电镜观察所制备的微球的表面形貌，结果如图1所示，所制备的rhBMP-2壳聚糖微球的球形良好，整个球体表面光滑无皱。应用扫描电镜测量所制备微球的直径，结果如图2所示，所得微球的平均直径为(108±56) μm，微球的范围控制在50～180 μm。 图1rhBMP-2壳聚糖微球的表面特征 图2rhBMP-2壳聚糖微球的粒径分布2.2 rhBMP-2壳聚糖微球的降解

　　通过溶菌酶的降解，壳聚糖微球重量逐渐减轻，图3显示壳聚糖微球重量变化情况。可见随时间延长壳聚糖降解率逐渐升高，第15 d时，壳聚糖微球的降解率仅为(12.4±2.5)%;第30 d时，降解率达(37.1±2.4)%。到观察终点45 d时，壳聚糖微球的降解率达到 (56.3±4.2)%。

　　2.3 微球载药量、包封率

　　rhBMP-2壳聚糖微球的包封率均大于(85.4±4.2)%，最高可达(90.1±1.6)%。如表1所示，制备BSA-壳聚糖微球时改变壳聚糖的量对微球载药性能的影响。从表中可以看出，随壳聚糖用量逐渐增大，微球载药量逐渐降低，但包封率逐渐增大。

　　2.4 rhBMP-2壳聚糖微球的累计释放率

　　图4显示rhBMP-2壳聚糖微球的体外释药情况。我们可以看到，rhBMP-2壳聚糖微球可以缓慢释放rhBMP-2达30 d以上，整个药物释放过程分为两个阶段(快速释放及缓慢释放阶段)。快速释放主要集中在0～10 d，累积释药率达(62.5±3.6)%。随时间的推移，药物释放逐渐平缓，进入缓慢释放阶段(20～30 d)，此时间段内rhBMP-2的释药率仅增加了7.5%。表1 壳聚糖用量对微球载药量和包封率的影响壳聚糖用量

　　3 讨论

　　rhBMP-2属于转化生长因子β超家族，是一种高效的骨诱导性物质，也是迄今最为肯定的骨诱导性物质。骨形态发生蛋白在人、猴、牛、兔不同种属间具有同源性，是具有独特的异位成骨生物学活性的骨生长因子，因而广泛应用于骨组织工程领域[1～3]。但纯化的骨形态发生蛋白半衰期很短，植入体内后会很快扩散并水解，而骨修复所需时间较长，因此，寻找能够缓慢释放rhBMP-2的方法具有实际应用价值[4、5]。 图3rhBMP-2壳聚糖微球的降解特征 图4rhBMP-2壳聚糖微球的累积释药率 目前，将rhBMP-2包裹在一定的载体制备成缓释微球，可减缓rhBMP-2的水解速度，持续发挥rhBMP-2的骨诱导活性。在药物微球缓释领域，寻找适宜的缓释载体是关键。壳聚糖是甲壳素(chitin)脱乙酰基的产物，具有的生物可降解性和生物相容性，是自然界中不可多得天然高分子载体材料[7～10]。目前，利用壳聚糖制备化疗药物、胰岛素、抗生素等药物的缓释、控释制剂及血脂吸附微球已取得较好的效果，部分已应用于临床[11、12]。鉴于以上优点，本课题选用壳聚糖作为rhBMP-2的缓释载体。

　　制备壳聚糖微球的常用方法有：相分离法、离子诱导法、乳化交联法、喷雾干燥法等[10]。本研究应用乳化交联的方法制备了rhBMP-2壳聚糖缓释微球。在以往研究中，戊二醛是最常用的交联剂，虽然在制备过程后期利用异丙醇，石油醚，双蒸水反复漂洗以去除可能残留的戊二醛，但不可避免残留少量的戊二醛，可能产生毒性。为了克服这一缺点，作者选用生物交联剂京尼平，据报道，京尼平的生物毒性是戊二醛的1/10 000[13]，因此，用京尼平制备出的微球理论上具有更好的生物安全性。

　　本实验应用1.5%壳聚糖凝胶制备出rhBMP-2壳聚糖微球。扫描电镜显示，微球的平均粒径为(108±56) μm，球体表面光滑、分散性良好。微球性能的体外检测发现，所制备的微球具有良好的载药性能，药物的包封率随壳聚糖的用量增加而提高，这可能是由于随着壳聚糖量的增大，增加了与药物结合的机率，使包封率增加。药物释放实验中，微球的药物释放分为两个阶段(快速释放及缓慢释放阶段)。快速释放主要集中在0～10 d，这与吸附于微球表面的药物溶解释放有关。随时间的推移，药物释放逐渐平缓，进入缓慢释放阶段，而缓慢释放阶段的释药与壳聚糖微球降解、包封于微球内部的药物释放有关。值得注意的是，本课题制备的rhBMP-2壳聚糖缓释微球可以缓慢释放rhBMP-2达30 d之久，具有用于骨组织工程的良好应用前景。

　　本课题利用乳化交联的方法制备出rhBMP-2壳聚糖缓释微球，体外性能检测，该微球具有很好的缓慢释放rhBMP-2的性能，有很好的骨组织工程应用前景。虽然通过ELISA法证实了微球可以充分负载rhBMP-2，且具有良好的缓释性能，但rhBMP-2壳聚糖微球是否能够发挥更好的骨诱导活性，仍需在进一步的体外和体内促进骨细胞增殖或诱导骨髓基质细胞分化的实验中证实，并且壳聚糖微球的生物相容性及体内的释药及降解情况也有待在以后的实验中进行验证。

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作者单位：第四军医大学西京医院全军骨科研究所，西安 710032