微囊化胰岛细胞移植治疗糖尿病的实验研究

【摘要】  目的 观察微囊化大鼠胰岛细胞移植治疗糖尿病小鼠的疗效。方法 将糖尿病小鼠随机分为三组：生理盐水注入组、未囊化胰岛细胞移植组和微囊化胰岛细胞移植组。将生理盐水、纯化大鼠胰岛细胞和囊化大鼠胰岛细胞分别移植于三组糖尿病小鼠腹腔。结果 分离的胰岛细胞对刺激反应良好，微囊化和未囊化胰岛细胞移植后均可纠正糖尿病小鼠的高血糖状态，但微囊化胰岛细胞移植组可维持正常血糖水平更长时间。结论 微囊化胰岛细胞移植治疗糖尿病小鼠具有良好的效果，微囊具有较好的免疫隔离作用。

【关键词】  微囊；胰岛细胞移植；糖尿病

    Experimental treatment of diabetes with microencapsulated rat islet cells transplantation

    FANG Lifeng （Department of Gastroenterology，the 1st People’s Hospital of Zhengzhou, Zhengzhou Henan 450004, China)

    Abstract: Objective   To observe the effect of treating diabetic mice with microcapsulated rat islet cell transplantation. Methods   Diabetic mice were randomly divided into 3 groups:control group， nomicroencapsulated islet cells transplantation group and microencapsulated islet cells transplantation group. Normal saline, pared rat islet cells and microcapsulated islet cells were respectively transplantated into abdominal cavity of three groups of diabetic mice. Results  The isolated islet cells had a good reaction for glucose stimulation. Both the microcapsulated islet cell transplantation and nonmicrocapsulated islet cell transplantation could be decreased the high blood glucose level，and the former one kept longer. Conclusion   It is believed that microcapsulated islet cell transplantation exerts good effect on diabetic mice and the microcapsules have good immunoisolating function.

    Keywords: microcapsulation; islet cell transplantation; diabetes

    胰岛移植不仅可以纠正糖尿病的高血糖状态，而且可以防止或延迟糖尿病并发症的发生和发展。异种胰岛远比人源胰岛来源丰富，但是严重的免疫排斥反应限制了异种移植。应用生物材料制作的海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微胶囊，其半通透性的囊膜将细胞包裹，只允许小分子的营养物和细胞分泌物自由通过，限制大分子的免疫成分和细胞进入，从而达到延长移植物存活的免疫隔离作用［12］。本实验将微囊化、未囊化的大鼠胰岛细胞分别异种移植到糖尿病模型小鼠体，以观察两种移植控制糖尿病小鼠血糖的效果。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    采用SD大鼠(180～220 g)、昆明小鼠(20～25 g)，雌雄不拘，由郑州大学实验动物中心提供。多聚赖氨酸、海藻酸钠、Histopaque1077、胶原酶、链脲霉素均为Sigma公司产品。RP MI1640为Gibco公司产品。胰岛素测定放免试剂盒为天津德普公司生产。京都2型血糖仪。

    1.2  动物模型制作

    小鼠腹腔注射链脲霉素(160 mg/kg)制作糖尿病小鼠模型，血糖连续2次高于16.5 mmol/L者定为糖尿病鼠。将糖尿病小鼠随机分为如下3组(每组5只)进行观察：①生理盐水注入组；②未囊化胰岛细胞移植组；③微囊化胰岛细胞移植组。

    1.3  胰岛分离与纯化

    SD大鼠腹腔内注射10%水合氯醛(500 mg/kg)麻醉，经胆总管插管注入胶原酶溶液(1 mg/mL)至胰腺完全充盈，迅速摘取胰腺置37 ℃水浴消化20～25 min，加入4 ℃ MHBSS缓冲液终止消化，震荡数次。180× g离心2 min，过300～400目滤网，将400目滤网反冲收集网上物，180× g离心2 min，连续2次，吸净上清液。向所得胰腺组织每管加入10 mL Histopaque1077分离液，震荡使胰腺组织与分离液混匀，再缓慢加入等体积的RP MI1640培养液，4 ℃ 900× g离心20 min，收集界面处的胰岛细胞，用MHBSS缓冲液洗涤3次。

    1.4  胰岛刺激试验

    倒置显微镜下挑选100～300 μm 的胰岛细胞置24孔板中，30个/孔。分别加入含2.75 mmol/L，16.5 mmol/L葡萄糖及16.5 mmol/L葡萄糖加0.5 mmol/L茶碱的RP MI1640培养液，37 ℃培养24 h后取上清液，用胰岛素放免试剂盒测定胰岛素分泌量。

    1.5  统计学处理

    所有数椐均以±s表示，采用SPSS13.0统计分析软件进行F检验法统计学分析。P＜0.05为统计学差异显著。

    2  结果

    2.1  葡萄糖刺激胰岛素分泌实验

    静止葡萄糖刺激试验显示所收获的胰岛细胞对葡萄糖刺激反应良好。在2.75 mmol/L和16.5 mmol /L葡萄糖及16.5 mmol/Ｌ葡萄糖加0.5 mmol/L茶碱作用下，平均每孔24个胰岛的胰岛素分泌量见表1，表明所收获的胰岛细胞具有调节性的胰岛素分泌功能。将分离的大鼠胰岛进行APA微囊化，所得微囊呈球形，表面光滑，直径在200～400 μm，每个囊内包裹有1～2个胰岛。将微囊胰岛进行胰岛素刺激释放实验，结果表明在上述的低糖、高糖和高糖加茶碱条件下其胰岛素分泌每24个胰岛分泌量见表1。表明微囊化大鼠胰岛仍维持较好的功能，且微囊及未微囊胰岛的胰岛素分泌无差异（见表1）。表1  微囊及未微囊大鼠胰岛的胰岛素分泌比较*：与未微囊胰岛组比较，P＞0.05

    2.2  胰岛细胞移植对糖尿病小鼠血糖水平的影响

    胰岛细胞移植前糖尿病小鼠血糖浓度为20.3～26.7 mmol/L。将所收获的胰岛细胞植入腹腔后，未移植组小鼠在观察期内呈持续高血糖状态，生理盐水注入组小鼠高血糖无明显改变，未囊化胰岛细胞移植组可使小鼠血糖降低持续3 d，而微囊化胰岛细胞移植组小鼠血糖降低可持续30 d以上(最长达100 d)，见表2。表2  糖尿病小鼠异体移植大鼠胰岛细胞前后的血糖变

    3  讨论

    由于胰岛移植可提供接近生理性的胰岛素分泌，对控制糖尿病慢性并发症具有积极意义。异种胰岛与人源胰岛相比具有丰富的来源，但是异种胰岛移植存在严重的免疫排斥反应。1980年，有作者发明了免疫隔离APA微胶囊，用其包裹异种胰岛后进行移植，可明显延长异种胰岛的存活和功能维持时间。最近该实验室以APA微囊化猪胰岛异种移植治疗自发性糖尿病猴的研究表明，通过1～3次移植，可使7只糖尿病猴在停用胰岛素的情况下，使禁食、血糖水平维持正常达120～804 d［24］。

    胰岛细胞移植可提供接近生理性的胰岛素分泌，对控制糖尿病慢性并发症具有积极的意义，是治疗糖尿病较理想的方法。我们在引进微囊制作技术的基础上，又改进了APA微囊制作技术，可根据胰岛细胞团的大小制出相应体积的微囊以减少机械性死腔，更有利于囊内胰岛细胞存活。通过采用一步法纯化胰岛细胞以缩短纯化时间，可减少梯度纯化对胰岛细胞的损伤［46］。本实验表明：未囊化胰岛细胞移植组糖尿病小鼠移植的大鼠胰岛细胞在3 d内可发挥降低血糖作用，3 d后因异体免疫排斥反应而丧失功能，使小鼠血糖上升至移植前水平。而微囊化胰岛细胞移植组小鼠血糖降低可持续30 d以上，最长一只达100 d，明显长于未囊化移植组［79］。移植30 d后，从小鼠腹腔回收的微囊大部分表面光滑、完整，证明APA微囊化胰岛细胞移植可在异种体内长期存活，APA微囊具有良好的生物相容性和免疫隔离作用，初步表明了APA微囊作为细胞系移植工具的可行性。

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作者单位：(郑州市第一人民医院消化科，河南 郑州 450004)