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【摘要】 目的 通过逆转录-DNA聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测豚鼠哮喘模型气管上皮内皮素-1（ET-1）mRˉNA表达，检测哮喘患者气管上皮内皮素-1（ET-1）和内皮素转换酶（ECE）mRNA表达。方法 （1）动物实验部分:Hartley株豚鼠用卵蛋白腹腔注射致敏，雾化吸入激发，提取气管上皮细胞RNA，逆转录将RNA逆转为cDNA，PCR扩增DNA。（2）临床实验部分:设对照组和哮喘组。一步法提取总RNA，逆转录合成cDNA，PCR扩增β-actin片段、ET-1片段和ECE片段。PCR产物的鉴定和半定量。计算ET-1/β-actin值和ECE/β-actin值。结果 （1）动物模型检测:在电泳缓冲液内，紫外灯下可见ET-1为333bp左右条带，与标记DNA条带相对应。（2）临床实验:哮喘组ET-1mRNA表达量明显高于对照组（P<0.05）。哮喘组ECEmRNA表达量与对照组比较差异无显著性（P>0.05）。结论 RT-PCR技术检测出卵蛋白致敏激发的豚鼠气管上皮细胞ET-1mRNA表达。哮喘患者支气管粘膜ET-1mRNA表达明显增高，而ECEmRNA表达量与对照组比较差异无显著性。
关键词 RT-聚合酶链反应 内皮素-1 内皮素转换酶
The mRNA expressions of endothelin-1and endothelin converting
enzyme in tracheal epithelium cell from guinea pig
asthma model and asthmatic patient
He Xiang，Liang Yongjie，Wang Shu，et al.
Dept.of Respiratory Disease，Affiliated Orient Hospital，Tongji University，Shanghai200120.
【Abstract】 Objective To detect the mRNA expressions of endothelin-1in tracheal epithelium cell from guinea pig asthma model by reverse transcriptional polymerase chain reaction，to detect the mRNA expressions of enˉdotheline-1and endothelin converting enzyme in tracheal epithelium cell from asthma patient.Methods （1）Animal experiment department:sensitize the guinea pig by inject ovi-protein into the abdominal cavity，excitation by aspirate the ovi-protein solutions，extract RNA from tracheal epithelium cell，reverse transcribe the RNA to cDNA，amplify DNA by polymerase chain reaction.（2）Clinical department:laying the asthema group and the control group，extract RNA from tracheal epithelium cell，reverse transcribe the RNA to cDNA，amplifyβ-actin、ET-1and ECE fragment by polymerase chain reaction.evaluate and semi-quantify the PCR product，calculate ET-1/β-actin and ECE/β-actin.Results （1）Animal experiment:we can see the ET-1is about a333bp strap in the electrophoresis solution under the infrared lamp，correspond with the marking strap.（2）Clinical department:The mRNA expressions of enˉdothelin-1of the asthema group is great high than the control group（P<0.05），the difference of mRNA expressions of ECE is not significant at two groups（P>0.05）.Conclusion It can detect the mRNA expressions of endothelin-l in tracheal epithelium cell from guinea pig asthma model by reverse transcriptional polymerasechain reaction.The mRNA expressions of endothelin-1of the asthema group is great high than the control group，The differece of mRNA expressions of ECE isnot significant at two groups.
Key words reverse transcriptional-polymerase reaction endothelin-1 endothelin converting enzyme
内皮素-1（ET-1）是至今所发现的最强烈的支气管平滑肌收缩物质之一，并有促进成纤维细胞和平滑肌细胞增殖，以及促进粘膜下腺体分泌的作用 ［1］ 。研究发现ET-1参与哮喘的发病和发展 ［2，3］ ，哮喘患者和动物模型的血浆 ［4］ 或气管上皮ET-1水平明显增高 ［5］ 。研究豚鼠哮喘模型气管上皮细胞ET-1mRNA表达的测定方法有助于进一步阐明支气管哮喘的发病机制，迄今尚未见有关报道。本实验通过逆转录-DNA聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测豚鼠哮喘模型气管上皮ET-1水平 ［6］ ，现报告如下。
1 对象与方法
1.1 动物实验部分 （1）对象:健康Hartley株豚鼠（复旦大学医学院动物房提供）共16只，体重200～250g，雌雄不拘。（2）主要仪器设备和试剂:DNA TRERMAL CYCLER480型自动PCR仪（PERKIN ELMER CETUS），CSD-L型超静台（上海净化设备厂），DY-A型电泳仪（上海生化工程研究所基巴斯公司），BF-300紫外线检测仪（四星公司），ALARM-1000型高速低温离心机（计田公司），37型雾化吸入器（ARI公司），扩增引物、逆转录酶、Taq酶及有关试剂购于上海试剂厂、上海基因公司、上海基康公司。（3）方法:①动物模型的建立:用10%卵蛋白溶液按100mg/kg，约0.2～0.25ml，对豚鼠行腹腔内注射致敏，2周后用1%卵蛋白溶液3ml雾化吸入，每次1min，每天1次共3次，激发豚鼠。②提取气管上皮细胞RNA:脱颈椎处死豚鼠，75%乙醇颈部皮肤消毒，剪开并固定皮肤，取出气管，刮净气管外膜，用生理盐水冲洗，置消毒平皿，携入超静台，剪开气管，加Trizol ［8］ 液1ml，用Tip头刮取气管上皮，并吹打至无团块，移入1.5ml EP管中，室温放5min，加0.3ml氯仿，用力晃摇1min，室温放3min，低温离心12000r/min×15min，将无机相移入新EP管中，加0.5ml异丙醇，室温放5min，低温离心12000r/min×20min，去上清液，加1ml75%乙醇洗管，加1ml100%乙醇，放入冰箱-70℃保存。③逆转录将RNA逆转为cDNA:将保存RNA的EP管低温离心10000r/min×10min;去上清液，加20μl DEPC水置于冰上，吸取4μg RNA液，加DEPC水稀释至12μl;加1μl Randon Prine，置70℃水浴×10min;加RT mix:Buffer5μl、dNTP2.5μl、M DTT2.5μl、RNase inhibitor1μl、M-MLV RTase1μl，置40℃水浴×1h，置95℃水浴×5min;加GOOD WATER35μl至60μl:-20℃保存。（4）聚合酶链反应（PCR）扩增DNA ［7］ :取cDNA液5μl、GOOD WATER35μl、Buffer5μl、Mgcl 2 2μl、引物各1μl、dNTP0.5μl、Taq酶0.5μl;94℃水浴×2min→（94℃水浴×1min→63℃水浴×2min→72℃水浴×2min，共5个循环）→（94℃水浴×1min→60℃水浴×1min→72℃水浴×1min，共30个循环）→72℃水浴×7min。
1.2 临床实验部分
1.2.1 对象 对照组10例，平均年龄（41±9）岁;哮喘组10例，平均年龄（38±7）岁，实验前3个月未应用糖皮质激素治疗。两组均为男性。
1.2.2 方法 （1）在电子纤维支气管镜直视下，钳取右中间支气管粘膜活组织3～5块。（2）根据一步法提取总RNA。（3）逆转录合成cDNA:取总RNA约1～5μg，用逆转录试剂盒（上海基因公司）合成cDNA。（4）PCR扩增cDNA:由上海生化工程公司合成以下引物:①肌动蛋白（β-actin）:上游:5′ATGTGGCACCACACCTTCTACATGAGCTGCG3′下游:5′CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC3′用此对引物扩增出838bp的β-actin片段。②ET-1引物:上游:5′AACˉCATGGATTATTTGTCCATG3′下游:5′AGTGTTGACCˉCAAATGATGTCC3′用此对引物扩增出230bp的ET-1片段。③ECE引物:上游:5′AGCGTGAGCGAGGCAGAGAG3′，下游:5′GGGGTAGAAGATGGTGTTGA3′，用此对引物扩增出567bp的ECE片段。④PCR反应条件:ET-1:92℃1min→42℃2min→72℃3min，共35循环。加强延伸:72℃10min。ECE:94℃1min→59℃2min→72℃1min，共35循环。加强延伸:72℃7min。（5）PCR产物的鉴定和半定量:反应完成后，取1～5μl PCR反应液进行2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察，可见ET-1为230bp条带、ECE为567bp条带、β-actin为838bp条带。在紫外凝胶图像分析仪上进行荧光度测定，计算ET-1/β-actin值和ECE/β-actin值。
1.3 统计学方法 两组实验结果以平均数±标准差表示，组间显著性差异检验采用配对t检验。
2 结果
2.1 动物模型检测结果 在2%琼脂糖内加入0.5μg/ml的溴化乙锭（EB），在加样孔内加入待测DNA与标记DNA，放入电泳仪，在电泳缓冲液内，电压80mV下电泳20～30min，放在紫外灯下观察，可见ET-1为333bp左右条带，与标记DNA条带相对应 ［9］ 。
2.2 临床实验结果 两组均有ET-1和ECEmRNA的表达。哮喘组ET-1mRNA表达量（ET-1/β-actin值为0.81±0.04）明显高于对照组（0.11±0.02），P<0.05。哮喘组ECEmRNA表达量（ECE/β-actin值为0.33±0.25）与对照组（0.32±0.12）比较差异无显著性，P>0.05。见表
1。
表1 哮喘组ET-1和ECE mRNA的表达 （略）
3 讨论
聚合酶链反应（PCR）是20世纪80年代发展起来的一种体外核素扩增系统，它是在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸等存在下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应，30个循环后扩增量为10 9 个拷贝。扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异结合。以前运用分子克隆法，费时、费力。