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【摘要】 目的 检测胃癌患者外周血CD3 + T细胞分泌细胞因子的水平变化，分析Th1和Th2细胞的细胞因子免疫活动，为肿瘤的免疫治疗提供实验依据。方法 首先用刺激物刺激细胞，增加细胞内细胞因子的表达。然后加入荧光标记的特异性抗细胞因子单克隆抗体，特异性抗原抗体结合，最后应用流式细胞仪分析特异性细胞因子表达水平。同时用酶联免疫吸附法（ELISA）检测相应的细胞因子。结果 胃癌患者Th1型细胞因子干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-12（IL-12）表达水平较正常对照组显著降低，Th2型细胞因子白细胞介素-4（IL-4）和白细胞介素-10（IL-10）表达水平较正常对照组升高，差异有统计学意义。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）表达水平较正常对照组升高，差异有显著性。结论 胃癌患者体内Th2型细胞因子模式占优势状态，这可能是肿瘤细胞发生免疫逃逸，从而导致肿瘤的发生或者转移的原因之一。
关键词 胃癌 细胞因子 Th1/Th2 流式细胞术
Clinical signficance of Th1/Th2cytokines in the peripheral blood
lymphocytes of patients with gastric cancer
Wu Ping，Chen Jie，He Huijuan，et al.
The Central Laboratory，Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang524001.
【Abstract】 Objective To detect the level of Th1and Th2type cytokines of peripheral blood CD3 + T lymˉphocytes in the patients with gastric cancer.In order to find out the laboratory evidence of tumor immunotherapy.Methods The peripheral blood lymphocytes were stimulated by stimulator in order to enhance expression of cyˉtokines.Specific fluorochrome-conjugated monoclonal antibody combinedwith antigen.Cytokines were detected by flow cytometry and ELISA.Results The level of Th1type cytokines such as interferon-γ（IFN-γ），interleukin-2（IL-2），interleukin-12（IL-12）were significantly lower in patients of gastric cancer than those of normal controls.The level of Th2type cytokines such as interleukin-4（IL-4），interleukin-10（IL-10）were higher in patients of gastric cancer than those of normal controls.There were significant difference between them.The levelof tumor necrosis factor a（TNF-α）in patients were significant higher than normal control.Conclusion Th1/Th2was imbalance in gastric cancer.Th1type cytokineswere inhibited，and Th2type cytokines were relatively enhanced，so Th1/Th2shiftto Th2.It maybe the mechanism of tumor arising and transferring by immune escaped from immunosurveillance.
Key words gastric cancer cytokines Th1/Th2 flow cytometry
辅助性T细胞（Th）对机体免疫系统有重要的调节作用。人在正常的生理情况下，Th1、Th2两类细胞处于相互抑制、相互转化的平衡状态，一旦平衡被打破，机体就会处于Th1优势或Th2优势的漂移状态，从而出现各种病理反应，甚至发生肿瘤 ［1～4］ 。Th1、Th2细胞这两种细胞均表达CD3、CD4抗原 ［5］ ，一般的免疫生化方法不能进一步区分这两种细胞，目前可利用流式细胞仪检测单个特应细胞分泌的特异性细胞因子水平 ［6］ ，分析其免疫细胞活动状态，从而有望研究出调控免疫反应的一套方法。我们应用流式细胞因子水平 ［6］ ，分析其免疫细胞活动状态，从而有望研究出调控免疫反应的一套方法。我们应用流式细胞仪通过Cyˉtodetect TM 试剂盒检测胃癌患者CD3 + T细胞分泌细胞因子的表达水平，用酶联免疫吸附（ELISA）法检测血清中相应的细胞因子水平，分析胃癌患者的Th1和Th2细胞免疫活动状态，为防治胃癌提供实验依据。
1 对象与方法
1.1 对象 胃癌55例，年龄44～84岁，平均62.5岁，男43例，女12例，其中高分化腺癌19例，中分化腺癌16例，低分化腺癌20例;根据国际UICC标准TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期22例，Ⅲ期19例，Ⅳ期14例，所选病例均经临床和病理诊断证实。正常对照30例，年龄42～75岁，平均58.5岁，均为健康体检者。
1.2 仪器 美国Coulter EPICSXL型流式细胞仪，美国Bio-Rad550型酶标仪，美国NAPCO5410型二氧化碳培养箱，日本三洋MDF-3820型-70℃超低温冰箱，上海安亭科学仪器厂TDL-5A型离心机。
1.3 主要试剂 Cytodetect TM 试剂盒系荷兰IMMUNO QUALˉITY PRODUCTS公司产品。RPMl1640培养液系美国GIBCO公司产品。淋巴细胞分离液系上海华精生物高科技有限公司产品。白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-4（IL-4）和TNF-αELISA法检测试剂盒系美国GeneMay公司产品。白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-12（IL-12）和干扰素-γ（IFN-γ）ELISA检测试剂盒系美国Genzyme公司产品。
1.4 实验方法
1.4.1 采集标本 所有患者均在手术前、部分病人在术后1个月及化疗后分别抽取静脉血7ml，其中2ml分离血清，-70℃冻存，用于细胞因子的ELISA法测定;5ml血肝素抗凝，用于Cytodetect测定。
1.4.2 Cytodetect测定 采用Cytodetect TM 试剂盒提供的方法。分离外周血淋巴细胞:采用Ficoll密度梯度离心法常规分离外周血淋巴细胞，所分离的淋巴细胞用RPMl1640培养液释为1×10 6 个细胞/ml备用。刺激细胞:（1）将1ml淋巴细胞悬液置于24孔培养板，培养孔加A试剂10μl，B试剂10μl，C试剂10μl。（2）37℃，5%CO 2 培养箱孵育5h。（3）刺激后转移细胞于一新离心管，加5ml洗涤剂洗涤，离心（1200r/min×10min），弃上清液。固定细胞:（1）加500μl冻固定液（4℃），室温下孵育10min。（2）加9ml洗涤剂洗涤，离心（1200r/min×10min），倒去上清液，以1ml洗涤剂悬浮细胞，置4℃冰箱过夜。细胞表面抗原染色:（1）从4℃冰箱取出固定后细胞液，加5ml洗涤剂洗涤，离心（1200r/min×10min），倒去上清液，以500μl洗涤剂悬浮细胞。（2）取100μl细胞悬液，加20μl抗细胞表面抗原的抗CD3-FITC，涡旋混匀，室温暗处孵育20min。细胞打孔:加1.5ml打孔液，离心（1000r/min×5min）。弃上清液，以100μl打孔液悬浮细胞。细胞因子染色:（1）加10μl抗细胞因子的单克隆抗体:抗IFN-γ-PE、抗TNF-α-PE、抗IL-2-PE、抗IL-4-PE、抗IL-10-PE、抗IL-12-PE，并另设一管加10μl该单克隆抗体的同型抗体。（2）4℃暗处孵育20min。（3）加1.5ml打孔液，离心（1000r/min×5min），弃上清液，以100μl HBSS液悬浮细胞，2h内上流式细胞仪分析。相应的细胞因子检测采用ELISA法，严格按说明书进行操作。
1.5 统计学方法 用SPSS10.0统计软件对实验数据进行统计学分析，数据以均数±标准差（ˉx±s）表示，用单因素方差分析对样本均数之间的差异显著性进行检验，用非参数检验的二项检验对计数资料进行检验。
2 结果
2.1 胃癌患者外周血CD3 + T细胞表达IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α细胞的百分比 见表1。胃癌患者Th1型细胞因子IL-2、IL-12和IFN-γ表达水平较正常对照组显著降低（P<0.01），而TNF-α表达水平较正常对照组显著升高（P<0.05）;Th2型细胞因子IL-4、IL-10表达水平与正常对照组升高，差异有显著性（P<0.05）。
2.2 胃癌患者血清细胞因子水平及其与肿瘤分化程度之间的关系 见表2。结果显示，不同分化程度的胃癌患者血清IL-2和IFN-γ与正常对照组相比均显著降低（P<0.01），但各分化程度之间差异无显著性。不同分化程度的胃癌患者血清IL-4和IL-10水平均显著高于正常对照组（P<0.05）。不同分化程度的肿瘤病人血清TNF-α显著高于正常对照组（P<0.01）;各组间差异无显著性（P>0.05）。胃癌组IL-12水平低于正常对照组，尤以低分化组降低显著（P<0.01）。
2.3 胃癌患者血清细胞因子水平及其与临床TNM分期之间的关系 见表3。结果显示，不同临床TNM分期的胃癌患者血清IL-2和IFN-γ与正常对照组相比均显著降低（P<0.01），各临床TNM分期之间虽然随着病程的进展有下降的趋势，但差异无显著性。不同临床TNM分期的胃癌患者血清IL-4和IL-10水平均显著高于正常对照组（P<0.05）。不同临床TNM分期的胃癌患者血清TNF-α显著高于正常对照组（P<0.01），各组间差异无显著性（P>0.05）。胃癌各组IL-12水平低于正常对照组，尤以Ⅳ期组降低显著（P<0.01）。
表1 胃癌患者与正常人外周血CD3 + T细胞表达IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ、TNF-α细胞的比较
注:与正常对照组比较 ˇ P<0.01， # P<0.05
表2 胃癌患者血清细胞因子水平的变化
注:与正常对照组比较: ˇ P<0.01， # P<0.05
表3 胃癌患者血清细胞因子水平与TNM分期的关系
注:与正常对照组比较 ˇ P<0.01， # P<0.05
3 讨论
传统检测Th1/Th2细胞的方法，多采用对标本中T淋巴细胞进行培养后测定培养上清液中的细胞因子成分，通过计算上述细胞因子的比率而推算Th1/Th2细胞频率，此项方法不够精确而且费时。本研究采用荧光标记的抗细胞因子单克隆抗体结合细胞固定、破膜打孔技术，用流式细胞仪来检测单个细胞水平内细胞因子的方法，能够大大地增加对Th1/Th2亚群检测的敏感性和特异性 ［6］ 。自从1986年提出Th1与Th2概念以来，人们对其在机体免疫反应中的作用进行大量的体外实验研究 ［7，8］ ，Th1细胞分泌IL-2、INF-γ和TNF-α等细胞因子，主要介导细免疫反应和迟发型超敏反应;Th2细胞分泌IL-4和IL-10等细胞因子，主要介导体液免疫反应。人在正常生理时，Th1/Th2类细胞因子处于平衡状态;当失衡时，即可导致机体免疫紊乱并诱发一系列的病理变化，其中包括肿瘤的发生发展。大量的研究证据表明Th1型细胞因子具有重要的抗肿瘤作用，IL-12可以上调IFN-γ的水平，