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【摘要】 目的 研究广州地区非霍奇金淋巴瘤（NHL）不同免疫表型与EB病毒（EBV）感染率的相关性，比较不同检测方法敏感性。方法 采用免疫组化、原位杂交以及聚合酶链反应（PCR）方法，从蛋白水平、RNA和DNA水平检测NHL中EBV的表达。结果 （1）206例NHL中EBV-LMP1的阳性率为20.0%，其中在B-NHL和T-NHL中阳性率分别为15.4%和34%。两者的差异有非常显著性（P=0.004）;（2）EBER1总阳性率39.3%，在B-NHL和T-NHL中阳性率分别为32.7%和60.0%，两者的差异有非常显著性（P=0.001）;（3）EBV-BamHIW检出阳性率，NHL（45.6%）与反应性增生淋巴组织（21.7%）差异有显著性（P=0.028）;（4）EBV-BamHIW和EBER1阳性检出率均高于EBV-BNLF1和LMP1，前两者的差异无显著性（P=0.085），且吻合度较高。结论 （1）广州地区非霍奇金淋巴瘤与EB病毒感染有相关性，其中T细胞淋巴瘤中EBV的感染率高于B细胞淋巴瘤;（2）PCR方法检测EBV-BamHIW和原位杂交法检测EBER1阳性率接近，敏感性均较高。关键词 EBV T-NHL B-NHL 免疫组织化学 原位杂交 PCR
Exploration on the relationship between EB virus infection rate and the different immunophenotype of non-Hodgkin lymphoma
Huang Hongyu，Qi Zongli，Han Xiqun，et al.
Department of Pathology，Nanfang Hospital，the First Military Medical University，Guangzhou510515.
【Abstract】 Objective To explore the relationship between Epstein-Barr virus（EBV）infection rate and the different immunophenotype of non-Hodgkin lymphoma（NHL）and compare the sensitivity among test methods.Methods Immunohistochemistry（IH）was performed for the latent membrane protein1（LMP1），in situ hybridization（ISH）for EBV-encoded small RNA1（EBER1）and polymerase chain reaction（PCR）for EBV-BamHIW and EBV-BNLF1after206cases of NHLs occurring in Guangzhou were categorized for B-cell lymphoma（B-NHL）or T-cell lymphoma（T-NHL）.Results （1）The positive rate of EBV-LMP1in NHLs was20.0%，including15.4%in B-NHLs and34.0%in T-NHLs.The results showed statistically significant（P=0.004）.（2）The positive rate of EBER1by ISHwas39.3%，which included32.7%in B-NHLs and60.0%in T-NHLs.The difference was statisˉtically significant（P=0.001）.（3）There was significant difference（P=0.028）between the detective rate of EBV-BamHIW in NHLs（45.6%）and that of benign lymphoproliferate tissues（5/23）.（4）There was no statistic signifiˉcance between the positive rate of EBER1and EBV-BamHIW（P=0.085），however they were both higher than that of EBV-BNLF1or EBV-LMP1in the NHLs.Conclusion （1）The results suggest that there is a high EBV infecˉtion rate in NHLs in Guangzhou，especially in T-NHLs.（2）ISH for EBER1and PCR for EBV-BamHIW are more sensitive among EBV detection methods.
Key words Epstein-Barr virus T-NHL B-NHL immunohisto chemistry in situ hybridization polyˉmerase chain reaction
EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）是疱疹病毒亚科中唯一能感染人类的淋巴滤泡病毒（lymphocryptovirus），它与人类多种疾病的发生有关。近年非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）与EBV感染的关系倍受人们的关注。广州地区属鼻咽癌的高发区，鼻咽癌的发生与EBV的感染密切相关，但本地区非霍奇金淋巴瘤与EBV的关系如何，不同免疫表型的非霍奇金淋巴瘤与EBV的相关性是否有差异非常值得探讨。本研究采用不同检测方法，从蛋白水平、RNA和DNA水平同步检测了不同类型的NHL中EBV ˇ 基金项目:广东省自然科学基金（020024）的表达情况，以期为广州地区非霍奇金淋巴瘤的病因学研究提供相关资料。
1 材料与方法
1.1 材料
收集广州市南方医院、广州市第一人民医院、解放军第157医院1997～2002年间诊断为非霍奇金淋巴瘤的外检病例蜡块，经连续切片、HE染色，由两位资深淋巴瘤专家读片（去除与NK细胞发生相关的鼻型NK/T细胞淋巴瘤、肝脾δT细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤以及皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤）206例确诊为NHL。所有病例均为本地生长的患者，其中男125例，女81例，男女性别之比约为3∶2，年龄7～85岁，中位年龄52岁。另收集反应性增生淋巴组织蜡块标本23例作对照。
1.2 方法
1.2.1 HE染色、免疫组织化学方法（SABC法）鉴别B-NHL和T-NHL 选用的一抗有B细胞抗体CD20、CD79a，T细胞抗体CD45RO、CD3（美国ZYMED公司产品）。
1.2.2 免疫组化方法（SABC法）检测EBV-LMP1 抗原修复方法采用抗原双暴露（胰酶消化+抗原热修复）。
1.2.3 EBER原位杂交 探针为本实验室设计的地高辛标记寡核苷酸探针，序列为:5’-CTA CAG CCA CAC ACG TCT CC-3’，每条探针5’端标记两个地高辛。原位杂交信号检测试剂盒为武汉博士德生物公司—敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅰ（过氧化物酶）。按试剂盒说明书操作。
1.2.4 PCR检测EBV-BamHIW和EBV-BNLF1基因片断扩增EBV-BamHIW引物1:5’-AAT G GG CGC CAT TTTGT-3’，引物2:5’-TCC CTA GAA CTG ACA ATT-3’目的片断长度为253bp。
扩增EBV-BNLF1引物1:5’-AGC GAC TCT GCT GGA AAT GAT-3’，引物2:5’-TGATTA GCTAAG GCATTC CCA-3’，目的基因片段长度为316bp。
反应体系为10×PCR buffer2.0μl，1.5mMMgCl 2 ，0.2mM dNTPs，P10.5μM，P20.5μM模板DNA（100～200μg/ml）5～10μl加三蒸水至20μl，混匀，再加入13μl石蜡油。模板DNA的提取，应用我室自行创建的石蜡切片刮片法 ［1］ ，组织消化后测OD值，使用前应用β-globin引物检测模板DNA的质量（略）。
1.3 统计学方法 结果采用卡方检验及吻合度检验。
2 结果
2.1 NHL分型结果 B细胞淋巴瘤156例，T细胞淋巴瘤50例。
2.2 206例NHL中EBV-LMP1检测结果 见表1（略）
2.3 206例NHL EBER原位杂交检测结果 见表2，图2（略）。
2.4 206例NHL PCR检测结果 见表3，图2，图3（略）。
2.5 不同方法的检测结果比较 见表4（略）。
3 讨论
EBV感染淋巴细胞后主要以潜伏状态存在于宿主淋巴细胞中，Joske等 ［2］ 实验证实了含特异受体的成熟B淋巴细胞是EB病毒感染的靶细胞，可使之发生转化成为永生的类淋巴母细胞系。EBV编码的LMP1是潜伏感染时表达的膜抗原中的一种，在被感染细胞的转化（transformation）过程中起重要作用。Kulwichit等 ［3］ 将LMP1基因转入三系小鼠均能诱发淋巴瘤，因此检测EBV-LMP1在研究EBV相关肿瘤中有相对重要的意义。本文对广州地区206例NHL进行检测，EBV-LMP1总阳性率为20.0%，T-NHL中EBV-LMP1的检出率（34.0%）显著高于B-NHL（15.4%）。olvius等 ［4］ 研究50例原发于口腔和唾液腺的非免疫缺陷相关B细胞淋巴瘤，发现只有1例表达LMP1;国内唐文台等 ［5］ 检测了63例B细胞淋巴瘤，也仅1例LMP1阳性，我们检测了156例B细胞淋巴瘤，结果（15.4%）显著高于其他报道（2.0%，1.6%），可能我们所检测的病员来自广州地区有关。另外，在实验中我们还发现，部分病例中LMP1阳性的细胞为R-S样细胞，Khan ［6］ 和Quintanilla-Martinez ［7］ 的实验中也发现了类似的现象，EBV在R-S样细胞的形成中的作用还有待研究。
EB病毒的早期核糖核酸（Epstein-Barr early RNA，EˉBER1/2）是EBV编码的两个相对分子量较小的RNA，在EBV转化细胞中也有高水平表达 ［8］ ，且能与某些蛋白结合形成稳定的二级结构的，在保存的石蜡组织标本中不易降解 ［9］ 。因此检测EBER1/2的表达已成为研究EBV潜伏感染的常规手段。我们应用原位杂交方法检测NHL石蜡包埋组织切片，EBER1阳性率为39.3%，T-NHL中的检出率（60.0%）显著高于B-NHL（32.7%），两者的差异有显著性。Zhou等 ［10］ 采用原位杂交和免疫组化方法检测42例国内北方人群T-NHL，EBV阳性率为62%的结果，Huh ［11］ 等检测韩国外周T-细胞淋巴瘤人群中EBV检出率为58%，我们的结果与之接近。
EBV-DNA在感染细胞内多为单拷贝，BamHIW基因在EBV-DNA中有10多次重复，因此可以通过检测该基因片断，研究组织中EBV的感染情况。因此，我们合成了特异性引物，采用PCR方法扩增非霍奇金淋巴瘤组织中EB病毒的BamHIW基因片段，阳性率为45.6%，稍高于EBER1（39.3%），但经统计学检验，差异无显著性，且两者的吻合度较高，故我们认为BamHIW亦是研究NHL与EBV关系较为敏感的指标。EBV-BNLF1是编码LMP1蛋白的基因，EBV-BNLF1具有肿瘤基因的特性，其表达产物是肿瘤形成过程中的重要的转化蛋白，故EBV-BNLF1被称为EBV 携带的恶性转化基因 ［12］ ，因此应用特异性引物，建立检测EBV-BNLF1的PCR方法，对肿瘤恶性程度的判断可能比扩增其它区域更有意义。本实验结果EBV-BNLF1基因扩增的阳性率（28.6%）高于LMP1（20.0%），原因除与实验方法的敏感性有关外，可能还与BNLF1基因的表达受多项因素的调控有关，如受其表达的调控基因EBNA2、EBNA3和宿主细胞的一致性等影响 ［13］ ;或者其持续表达不是维持细胞恶性表型所必需的，它的表达可能只发生在肿瘤发生的某一阶段，故部分BNLF1片断阳性的病例无LMP1的表达。虽然两者的阳性率有差异，但吻合度较高。
本文采用免疫组化、原位杂交以及聚合酶链反应（PCR）方法分别从蛋白水平、RNA水平、DNA水平检测了NHL中EBV的表达，结果均提示广州地区NHL有较高水平的EB病毒感染，其中T-NHL中EB病毒感染率更高。在几种不同的检测方法中，原位杂交检测EBER1与PCR方法检测BamHIW基因的阳性率接受，两种方法的敏感性均高于免疫组织化学方法检测EBV-LMP1和PCR法检测EBV-BNLF1，原位杂交方法既敏感又可准确定位，但耗时较长;PCR方法敏感性高，特异性强，短时间内可出结果，但缺点不能定位。因此在探讨NHL与EB病毒感染相关性时可根据需要选择其一。
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（收稿日期:2004-04-10） 作者单位:510515广州第一军医大学南方医院病理科 （编辑李 木）