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【摘要】 目的 分别用商品化试剂盒和笔者摸索改良的裂解液煮沸法从血清标本中提取HBV DNA，比较二者的提取效果。方法 收集40例经商品化试剂盒荧光PCR定量检测HBV DNA含量全部＞1.0×104copies/ml的血清标本，然后用笔者摸索改良的裂解液煮沸法提取标本中的HBV DNA，进行荧光定量PCR检测，对检测结果进行统计学分析。结果 两种方法提取的HBV DNA含量差异无显著性（P>0.05）。结论 裂解液煮沸法是一种快速、高效的提取血清中HBV DNA的方法。
【关键词】 乙型肝炎病毒；DNA提取
A kinds of fast methods to extract HBV DNA from serum samples
GUO Long-hua，HUANG Xian-zhang，ZHUANG Jun-hua.Clinical Laboratory of Ersha Island Branch，Guangdong Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 510105，China
【Abstract】 Objective To chose a way that can quickly extract HBV DNA templates from serum samples by comparing the effect of two kinds of methods.Methods The author collected 40 samples proved by the fluorescence PCR with HBV DNA level beyond 1.0×104 copieds/ml,extracted HBV DNA templates from the serum samples by the way of seething with disruption liquid and compared the concentration of HBV DNA templates.Results There is no distinct difference between the effect of the way of seething with disruption liquid and the kit way（P>0.05）.Conclusion The way of seething with disruption liquid is a quick,and high efficient way to extract HBV DNA templates from serum samples.
【Key words】 hepatitis B virus; DNA
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）是不完全环状双链DNA病毒，全长约3.2kb，是目前已知对人类致病的最小双链DNA病毒，严重威胁着人类生命健康。乙型肝炎是一种世界性的传染病，全球乙型肝炎患者和HBV携带者约有3亿多，其中我国达1亿之多。随着分子生物学技术的发展，人们可以通过检测血液中HBV DNA含量了解病情和判断药物的疗效，近些年来HBV的变异一直是人们研究的热点［1~3］，这些都需要从血清中提取HBV DNA，如何快速、高效提取血清中HBV DNA就显得很重要。笔者在实践中摸索出裂解液煮沸法检测HBV DNA，现介绍如下。
1 材料与方法
1.1 材料 （1）标本：收集40例HBV DNA含量全部＞1.0×104copies/ml的血清标本（来源于我院门诊和住院病人），HBV DNA含量均值为1×106.68±1.12copies/ml。（2）主要仪器:Roche公司Light Cycler型荧光定量PCR仪、飞鸽牌TGL-16B台式高速离心机。（3）主要试剂:广州达安基因公司HBV DNA荧光PCR定量检测试剂盒，裂解液（自配）。
1.2 方法 （1）用广州达安基因公司HBV DNA荧光PCR定量试剂盒的方法提取血清中HBV DNA，用荧光PCR仪检测HBV DNA模板含量。收集40例HBV DNA含量全部＞1.0×104copies/ml的血清标本。（2）裂解液煮沸法：是经作者摸索改良的方法［4］。裂解液配制参照文献［5］（10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA,15mmol/L NaCl,0.5%SDS,pH为8.0）。取50μl血清加10μl裂解液，混匀，煮沸10min,5000×g离心5min，取上清液备用，平均每管大约可以取到20μl上清液。提取上述标本的HBV DNA，用荧光PCR仪检测HBV DNA模板含量。
1.3 统计学方法 利用SPSS 10.0统计软件对HBV DNA模板含量进行成组t检验分析，以P>0.05为差异无显著性。
2 结果
两种方法提取的HBV DNA含量检测结果 见表1。表1 两种方法提取的HBV DNA含量的比较 由表1可知，裂解液煮沸法与试剂盒法HBV DVA含量比较，t=1.35，P>0.05，表明两种方法提取的HBV DNA含量差异在统计学上无显著性。
3 讨论
血清中HBV DNA的提取方法有多种，商品试剂盒也多种多样，但绝大多数试剂盒的原理和试剂配方是保密的，并且成本较高。目前国内文献中提取HBV DNA使用较多的是苯酚法，该法虽然提取的DNA纯度较高，但DNA损失量较大，同时苯酚法操作繁琐、耗时、易污染，不适宜大批量标本分析［6］。碱裂解法虽然快速简便，但去蛋白效果不好，明显影响了PCR效果。裂解液煮沸法虽然不能完全去除蛋白质，但少量蛋白质不影响PCR扩增效果，且该法快速简便，用此法提取的HBV DNA作PCR模板是可行的。
通过与商品化试剂盒的比较，发现裂解液煮沸法是一种快速、高效的提取血清中HBV DNA的方法。裂解液煮沸法能为HBV的检测、分子生物学和分子流行病学研究带来很大的方便，尤其适用于大批量标本，同时可节约实验成本和时间，具有很大的应用价值。
【参考文献】
1 Friedt M, Gerner P, Lausch E, et al. Mutations in the basic core promoter and the precore region of hepatitis B virus and their selection in the children with fulminant and chronic hepatitis B. Hepatology,1999,29（4）:1252.
2 Genie Bang, K-H Kim, Michael G, et al. Effect of mutating the two cysteines required for HBe antigenicity on hepatitis B virus DNA replication and virion secretion.Virology,2005,332:216.
3 Takahashi k, Ohta k, Akahane Y, et al. Clinical implications of mutations C-to-T1653 and T-to -C/A/G1753 of hepatitis B virus genotype C genome in chronic liver disease. Arch Virol,1999,144:1299.
4 郭龙华,董长垣,高婧,等.一种从血清标本中快速提取HBV DNA方法的建立.武汉大学学报（医学版）,2005,26（3）:333.
5 姜军平.实用PCR基因诊断技术.北京：世界图书出版公司,1996,75-76.
6 Kramvis A, Bukofzer S, Kew MC. Comparison of hepatitis B virus DNA extractions from serum by the QIAamp blood kit, GeneReleaser, and the phenol-chloroform method. J Clini Micro,1996,34（11）:2731.
作者单位： 510105 广东广州，广东省中医院二沙岛分院检验科
（编辑：陆 淼）