硝基酪氨酸在2型糖尿病大鼠肾脏的表达及瑞舒伐他汀钙的影响

【摘要】  目的　观察硝基酪氨酸在2型糖尿病模型大鼠肾脏的表达及瑞舒伐他汀钙(rosuvastatin)对其的影响。方法　将大鼠分为正常对照组(C)、糖尿病组(D)、瑞舒伐他汀钙治疗组(N)，比较各组大鼠肾组织中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性和硝基酪氨酸(NT)含量，同时观察血糖、血胰岛素、肾功能和肾脏形态变化。结果　与正常组比较，糖尿病组肾组织中MDA含量明显上升(P<0.05)，SOD活性显著下降(P<0.05)，NT增多(P<0.05)，肾功能和肾脏形态受损，而瑞舒伐他汀钙治疗组的上述表达较糖尿病组明显改善。结论　硝基酪氨酸在糖尿病肾病中的表达明显增加，而瑞舒伐他汀钙可以通过抑制氧化应激反应对2型糖尿病模型大鼠肾脏产生保护作用。

【关键词】  硝基酪氨酸;瑞舒伐他汀钙;糖尿病肾病;氧化应激

　　　Objective　To evaluate the expression of nitrotyrosine in the kidney type 2 diabetic rats and observe the effect of Rosuvastatin on nitrotyrosine.Methods　25 rats were divided into 3 groups of normal rats(C)，diabetic rats(D)，diabetic rats treated with Rosuvastatin (N).Content of malonaldehyde(MDA)，activity of antioxidant enzymes including superoxid edismutase(SOD) and nitrotyrosine(NT)in the renal tissue were compared among the groups.Inaddition，blood glucose，serum creatinine(Cr)blood ureanitrogen(BUN)were mesured;the renal tissue were observed by light micros copy and electron microscopy.Results　Compared with normal group，the level of BUN，Cr，MDA and NT in diabetic rats were significantly increased，but the activity of SOD were decreased notably.In addition，the renal pathologic detriment significantly higher than normal controls.But those were improved in the treated group obviously.Conclusion　Oxidative stress take an important role in the development of diabetic nephropathy.The expression of Nitrotyrosine in type 2 diabetic rats were increased. And antioxidation may be the possible mechanism of the neohroprotective action of Rosuvastatin.

　　[Key words]　nitrotyrosine;rosuvastatin;diabetic nephropathy;oxidarive stress

　　氧化应激主要是通过自由基对体内的DNA、蛋白质和脂肪的氧化修饰导致组织损伤。越来越多的证据表明，糖尿病引起的氧化应激是导致糖尿病慢性并发症的最根本原因之一[1]。深入研究糖尿病中的氧化应激，研究和开发新的抗氧化药物，将为糖尿病慢性并发症的预防和治疗提供新的方向和途径。瑞舒伐他汀钙上市以来，主要作为降胆固醇及抗动脉粥样硬化药。近年来，大量资料及体内外试验表明，其也有很强的抗氧化作用，而硝基酪氨酸(nitrotyrosine，NT)是自由基引起蛋白质损伤产生，可以作为过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite，ONOO-)的特异性标志物，目前有关NT在糖尿病肾脏的表达国内甚少报道。本实验以2型糖尿病(DM)模型大鼠为研究对象，探索观察糖尿病大鼠肾组织NT的表达，并进一步观察瑞舒伐他汀钙对NT表达以及对其他氧化应激标志物的影响。

　　1　材料与仪器

　　1.1　实验动物

　　25只清洁级Wistar大鼠，雄性，购自河南大学动物中心，体重100～150g。

　　1.2　试药

　　链尿佐菌素(STZ，德国MERCK公司，以0.1mol/L、pH为4.2的枸橼酸缓冲液溶解，临用前配制);瑞舒伐他汀钙(商品名瑞舒伐他汀钙，阿斯利康制药有限公司);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、硝基酪氨酸检测试剂盒(美国Cayman公司)。

　　1.3　仪器

　　紫外分光光度计 (上海分析仪器厂);自动生化分析仪 (美国Technicon公司);磁酶联免疫测定仪(北京倍爱康生物技术有限责任公司)。

　　2　方法

　　2.1　动物分组与处理

　　大鼠适应性饲养1周后，按体重随机分为正常对照组 (C组，7只)和实验组(B组，18只)。C组给予普通食料，B组给予高糖、高脂饮食 (由常规饲料加15%蔗糖、5%猪油、0.5%胆固醇配制而成)。4周后B组腹腔注射STZ(注射量为35mg/kg),72h后经尾静脉采血测空腹血糖(FBG)。以禁食后血糖水平≥空白组均数±3倍标准差为标准，判定2型糖尿病大鼠模型是否建立成功。成功者(共 14只)再随机分为糖尿病组 (D组，7只)和糖尿病瑞舒伐他汀钙治疗组(N组，7只)，N组以瑞舒伐他汀钙500mg/(kg?d)灌胃，C组、D组则给予相同剂量的蒸馏水各组大鼠均单笼饲养，自由进食、饮水，给药8周后代谢笼收集24h尿液，低温离心后测尿微量白蛋白。后麻醉大鼠，自下腔静脉取血，摘取双侧肾脏，称重，取部分皮质以4%的多糖甲醛固定，部分以3.7%的戊二醛液固定。

　　2.2　检测项目与方法

　　2.2.1　生化指标的检测

　　血糖水平用葡萄糖氧化酶法检测，血胰岛素水平采用磁酶联免疫吸附法检测，血尿素氮 (BUN)、血肌酐(Cr)由自动生化分析仪检测，24h尿微量白蛋白采用放射免疫法测定。

　　2.2.2　肾组织匀浆中MDA含量、SOD活性的测定

　　将10%的组织匀浆低温离心，取上清液，采用化学比色法测定光吸收度，计算MDA、SOD含量。

　　2.2.3　肾组织免疫学检查

　　常规脱蜡，封闭，一抗37°C孵育2h,4°C冰箱过夜，标记二抗，做免疫染色，应用高清晰度彩色免疫图像分析系统(IPP55.0)分析，测定肾小球(平均光密度)直径。

　　2.2.4　肾脏组织电镜观察

　　肾组织固定，脱水，包埋，切片，染色，在Hitachi-7500透射电镜下观察。

　　2.3　统计学处理

　　实验数据以±s表示，应用SPSS13统计软件进行处理，两组间数据采用ANOVA检验，若方差不齐，采用非参数统计检验，P<0.05为差异有显著性。

　　3　结果

　　3.1　各组大鼠血糖、肾功能及病理形态的变化

　　见表1。表1　各组大鼠尿白蛋白、血糖、BUN、Cr的变化

　　3.2　正常对照组、糖尿病组、糖尿病瑞舒伐他汀钙治疗组病理改变

　　见图1。　镜下观察发现，D组大鼠GBM明显增厚，系膜区增宽，部分肾小球出现硬化，经瑞舒伐他汀钙治疗后，上述病理改变得到改善。

　　3.3　正常对照组、糖尿病组、糖尿病瑞舒伐他汀钙治疗组超微结构改变

　　见图2。图2　正常组(C组)( 7000)、糖尿病组(D组)( 10000)、糖尿病瑞舒伐他汀钙治疗组(N组)( 8000)肾脏超微结构由图2可见，C组肾小球基底膜结构清晰完整，血管内皮细胞足细胞未见异常。D组基底膜不均匀增厚，内皮细胞排列紊乱，脱落，完整性破坏，足突增粗融合。肾小管上皮肿胀。部分溶酶体内可见空泡变性，线粒体肿胀。N组亦可见上述变性，但程度较D组减轻。

　　3.4　各组大鼠肾组织中MDA含量、SOD活性及硝基酪氨酸(NT)的变化

　　见表2、图3。表2　各组大鼠肾组织中MDA含量、SOD活性及NT变化造模8周后，D组肾组织中MDA含量较同期C组明显升高，而SOD活性则较同期C组下降。经瑞舒伐他汀钙治疗后，N组MDA含量较同期D组明显下降，S0D活性则较同期D组增加，造模8周后，D组肾组织中硝基酪氨酸(NT)活性较同期C组明显升高。经瑞舒伐他汀钙治疗后，N组肾组织中硝基酪氨酸(NT)活性较同期D组明显下降。

　　3.5　各氧化应激指标与尿白蛋白和Cr的相关分析

　　见表3。表3　MDA、SOD、NT与24h尿微量白蛋白、血Cr 相关分析表3表明MDA、NT与24h尿微量白蛋白、血Cr呈明显的正相关，而SOD与24h尿微量白蛋白、血Cr呈明显的负相关。

　　4　讨论

　　DN是致糖尿病终末期发生肾衰竭的重要原因，其发病机制及治疗方法是目前研究的热点之一。因2型糖尿病发病率占DM总发病率的90%，故以2型糖尿病模型作为研究对象。在本实验中，成功建立了2型DM的大鼠模型。该模型发病过程及特征与2型糖尿病的临床过程和代谢特征类似。

　　本研究发现，12周后，糖尿病大鼠各种氧化应激指标包括MDA和NT都明显增高，而抗氧化指标SOD则明显低于正常对照，说明2型糖尿病大鼠的抗氧化能力明显下降，氧自由基生成增多，促进了糖尿病的发生，这与近年的其他研究一致[2,3 ]。氧化应激是指体内活性氧类生成和抗氧化防御功能之间平衡的紊乱。机体受到外来的刺激，激活细胞质膜上的还原型辅酶Ⅰ(NADPH)氧化复合体发生呼吸链级链反应，释放出大量的ROS。ROS是生物体内有氧代谢过程中产生的活性产物，主要包括氧自由基、过氧化氢、氢氧自由基、单线态分子氧、过氧化酯类等。其具有一定的毒性。DM时高血糖可激活细胞内蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)信息传导途径，PKC在巨噬细胞和非巨噬细胞的还原型烟酰胺酰嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶的活化过程中起重要作用，而NADPH氧化酶被认为是ROS产生的最重要机制[4]。高糖引起的线粒体内膜电位差增大，形成超极化，通过辅酶Q的电子传递链使氧分子还原，产生大量的ROS[5]。线粒体电子传递链复合物的抑制剂可有效抑制高糖引起的大鼠肾系膜细胞和肾小管上皮细胞中ROS的含量也证实了这点[6]。

　　本研究还表明糖尿病的氧化应激与糖尿病肾病的发生存在密切关系，2型糖尿病大鼠成模12周后，BUN、Cr和ALB升高，DBM增厚，系膜区明显增宽，部分肾小球出现硬化，足突成阶段性融合，说明高糖状态下肾脏功能和形态均受到损伤。相关分析表明糖尿病大鼠尿白蛋白排量、Cr与NT和 MDA呈正相关，与SOD呈负相关，说明氧化应激参与了糖尿病肾病的发生发展。Chang等发现局部氧自由基水平与肾小球硬化和系膜增生相关[7]，在糖尿病发展中起重要作用。因此，抗氧化治疗可减轻DM引起的肾脏损伤。

　　NT是自由基引起蛋白质损伤的一个重要标志物，目前认为硝基酪氨酸是ONOO-在体内生成的特异性标志物，能敏感反映ONOO-含量[8]。近年研究发现糖尿病肾病时NT表达明显增高[9,10]，是肾小球细胞蛋白质氧化应激的指标。本研究发现成模后的2型糖尿病大鼠肾脏的NT表达明显高于正常组(P<0.05)，并与24h尿白蛋白排量密切相关，说明氧化应激在糖尿病肾病的发病机制中起重要作用。

　　本研究通过瑞舒伐他汀钙抗氧化治疗，造模12周后，发现瑞舒伐他汀钙治疗组氧化指标MDA的水平明显减少，SOD的含量增加，同时使尿白蛋白水平下降，肾脏病理和超微结构都有明显的好转，表明其改善了氧化应激状态，缓解了肾损伤，保护了肾脏功能。瑞舒伐他汀钙自上市以来，主要作为降胆固醇及抗动脉硬化药。近年来，瑞舒伐他汀钙的强抗氧化作用较其降脂作用更受到人们的关注。研究发现瑞舒伐他汀钙对体内脂质有较强的抗氧化作用[11,12]，在一些干预动脉硬化的实验中发现瑞舒伐他汀钙能够减少NT的含量[13]。本实验中瑞舒伐他汀钙治疗组肾脏NT的表达较糖尿病组明显下降(P<0.05)，初步证实了瑞舒伐他汀钙可以改善肾脏蛋白质的损伤，减轻肾脏氧化应激的损害。

　　总之，此次实验发现氧化应激在糖尿病肾病的发病机制中可能具有重要的作用，NT是糖尿病肾脏氧化损伤的一个敏感的标志物，瑞舒伐他汀钙通过抑制体内脂质和蛋白质的氧化应激作用对糖尿病肾脏起到一定的保护作用，对其作用机制有必要再进行深入研究，以便为临床应用提供更具体的理论依据。

　　(本文彩图见封三)

【参考文献】
  　　1　Browlee M.Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complication.Nature,2001,414：813-820.

　　2　Yizhen Xu， Brent W Osborne， Robert C Stanton. Diabetes causes inhibition of glucose-6-phosphate dehydrogenase via activation of PKA， which contributes to oxidative stress in rat kidney cortex. Am J Physiol Renal Physiol,2005,289： F1040 - F1047.

　　3　Daisuke Koya， Kazuyuki Hayashi， Munehiro Kitada，et al.Effects of Antioxidants in Diabetes-Induced Oxidative Stress in the Glomeruli of Diabetic Rats. J Am Soc Nephrol,2003,14： 250.

　　4　Wu LL，chiou CC，Chang PY，et al.Urinary8-OHdG：a marker of oxidafives tress to DNA and a risk factor for cancer ，at heroseclerosis and diabetics . Clin Chim Acta,2004,339：1-9.

　　5　Nishikawa T， Edelstein D，Du XL，et al.Normalizing mitochomdrial superoxide production blocks three diffrernt pathways of hyperglycemic damage.Nature,2000,404：787-790.

　　6　Echtay KS，Roussel D，St-Pierre L，et al.Superoxide activates mitochondrialuncouplingp roteins.Nature,2002,415：96-99.

　　7　Chang JM， Kuo MC， Kuo HT，et al.Increased gomerular and extracellular malondialdehyde levels in patients and rats with diabetic nephropathy. J Lab Clin Med， 2005,146：210-215.

　　8　Ischiropoulos H，Zhu L，Chen J，et al.Peroxynitritemediated tyrosine nitration catalyzed by superoxide dismutase.Arch Biochem Briphys,2001,298：431-437.

　　9　Qiuling Fan， Jie Liao. Candesartan reduced advanced glycation end-products accumulation and diminished nitro-oxidative stress in type 2 diabetic KK/Ta mice. Nephrology Dialysis Transplantation,2004,19(12)：3012-3020.

　　10　Praveen N. Chander.Nephropathy in Zucker Diabetic Fat Rat Is Associated with Oxidative and Nitrosative Stress： Prevention by Chronic Therapy with a Peroxynitrite Scavenger Ebselen . J Am Soc Nephrol,2004,15：2391-2403.

　　11　Yoshida M，Kimura H，Kyuki K，et al. Combined effect of probucol and insulin on renal damage in diabetic rats fed a high cholesterol diet.Eur J Pharmacol,2006,548(1-3)：174-180.

　　12　Kim DS，Kim HR. Protective effect of calceolarioside on adriamycin-induced cardiomyocyte toxicity. Eur J Pharmacol,2006,541(1-2)：24-32.

　　13　Kyoko Umeji， Seiji Umemoto.Comparative effects of pitavastatin and probucol on oxidative stress， Cu/Zn superoxide dismutase， PPAR- γ.and aortic stiffness in hypercholesterolemia.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006,291：H2522-H2532.