LacZ DNA 标记的腺病毒在高氧性肺损伤基因治疗中的转染和致炎作用

【摘要】  目的观察LacZ DNA 标记的腺病毒在高氧性肺损伤基因治疗中的转染和致炎作用。方法装载LacZ DNA 的腺病毒在小鼠高氧模型开始前2天经鼻腔送入体内，X-gal 染色和β-半乳糖酶活性测定用于确定LacZ DNA在肺内转染的分布及其蛋白表达产物的活性;小鼠肺干/湿重比和支气管肺泡盥洗液(BALF)内的蛋白浓度的测定用于鉴定腺病毒在基因治疗过程中可能存在的致炎作用。结果X-gal 染色显示LacZ DNA在高氧前及后均可广泛转染在肺各级支气管和肺泡上皮细胞，β-半乳糖酶活性的测定提示了LacZ DNA 可成功地翻译成其蛋白质表达产物并表现为高表达;同时，腺病毒的致炎作用在高氧吸入48h后示小鼠肺干/湿重比和BALF蛋白浓度均较其他对照组明显升高，但其升高的程度可在24h后迅速缓解上升趋势。结论腺病毒为载体的基因治疗可有效地转染标记基因，同时，腺病毒虽在基因治疗的过程中有一定的致炎作用，但是暂时的，其仍是有效的DNA载体。

【关键词】  腺病毒;基因治疗;LacZ;高氧性肺损伤;载体

　　ObjectiveTo investigate the effects of gene transfer and endogenous inflammation of adenovirus marked by LacZ DNA to hyperoxia lung injury in gene therapy. MethodsAdenovirus encoded LacZ DNA was intranasal administered to mice at 2 days earlier before 100%O2 inhalation, X-gal staining and activity measurement of β-gal protein translated from LacZ DNA were applied to determine the level of LacZ DNA transfer and it's protein expression; meanwhile, mouse lung wet/dry ratio and protein concentration in bronchus alveolar fluid were measured to valuate the degree of inflammation reaction from adenovirus.ResultsX-gal staining showed LacZ DNA could transfer broadly in series of lung bronchus and alveolar epithelial cells no matter before or after 100%O2 inhalation; β-gal protein activity measurement presented LacZ DNA could successfully translated into it's protein expression with high level expression; meanwhile, endogenous inflammation of adenovirus showed mouse lung wet/dry ratio and protein concentration in bronchus alveolar fluid were significantly increased at the 48h of 100%O2 inhalation compared to control groups, but lost the pattern of continue increasing after anther continual 24 h of 100%O2 inhalation.ConclusionBeing vector of gene therapy, adenovirus could successfully transfer target DNA, while, adenovirus would bring some degree of endogenous inflammation, but it is temporarily, it is still a validity vector in gene therapy.

　　[Key words]adenovirus;gene therapy;LacZ;hyperoxia lung injury;vector

　　基因治疗(gene therapy)是指将外源正常基因通过载体导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，从而达到治疗目的。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。携带基因进入细胞内表达的载体有病毒载体和非病毒载体,其中病毒载体又分腺病毒、腺病毒相关病毒、逆转录病毒载体等;非病毒载体包括脂质体、磷酸钙、基因枪等。腺病毒是基因治疗的主要载体，并占所有基因治疗研究中的28%[1，2]。急性肺损伤(ALI)是严重威胁生命安全的常见急危重症，其病死率在我国高达60%～70%。传统的ALI治疗方案对挽救生命和疾病转归影响有限[3]，因此，尝试新的治疗手段如基因治疗已是目前研究的热点。然而，关于腺病毒自身的致炎作用在以其为载体的基因治疗对ALI治疗效果影响的报道尚少见。本研究在建立小鼠ALI疾病模型的基础上，观察了腺病毒的转染和致炎作用对小鼠ALI基因治疗效果的影响及意义。

　　1材料与方法

　　1.1材料动物：本所研究使用的小鼠均获得美国宾夕法尼亚大学动物部批准。小鼠随机性分为4组：(1)氧气吸入前对照组(Con组)15只;(2)LacZ DNA 标记的腺病毒治疗组(AdLacZ组)20只;(3)磷酸盐缓冲液(PBS)治疗组(PBS组)20只;(4)无治疗组(无治疗组)20只。

　　1.2方法

　　1.2.1经鼻腔通道的治疗方法在100% O2暴露前2 天，根据小鼠体重将腺病毒浓缩制剂用缓冲剂调整到每只小鼠给药50 μl，并将总容量分为4次在小鼠麻醉状态下呈垂直位时经鼻腔吸入。

　　1.2.2高氧性肺损伤模型各组小鼠随机取样后，将他们同时暴露于100%O2灌注的氧舱内以制造高氧性肺损伤动物模型。氧舱内氧流量为6～8 L/min，舱内氧气交换频率是6～7次/ h，CO2<0.2%，湿度约45%，并维持约12h的白天黑夜交替。在100% O2吸入后的24、48和72h，分别收集肺组织和肺泡灌洗液等标本以备检测之用。

　　1.2.3标本的收集和处理在高氧吸入前及后的24、48和72h，应用苯巴比妥(50mg/kg)腹腔深度麻醉小鼠后，暴露小鼠主气管并行气管插管和机械通气。沿胸腹中线切开皮肤和腹部皮下组织以暴露腹腔脏器和腹主动脉。隔断腹主动脉放血以减少肺部血流量，随后，打开胸腔，分离心脏及肺旁结缔组织，并经右心室穿刺，肺泡灌流液以20～30cm H2O(1cm H2O=0.098 kPa)水压经右心室灌流肺组织，至肺组织内血液冲洗干净。分离出的肺组织在液氮中快速冷藏，并将肺标本保存在-80℃的冰箱内以备用。另外，在机械通气后及肺泡灌流之前，用注射器灌洗肺泡3次，并收集支气管-肺泡灌洗液。灌洗后的肺组织经由主气管灌入4%的甲醛溶液至肺泡内以备用于肺组织的细胞化学染色。

　　1.2.4 X-gal染色β-半乳糖酶(X-gal)染色[4 ]可以提供LacZ DNA整合到肺上皮细胞DNA后的蛋白表达分布的影像学分析。新鲜整体肺组织在福尔马林液内固定并彻底漂洗后，在X-gal复合试剂(K4Fe(CN)6-3H2O，K3Fe(CN)6，2mM MgCl2 and 0.5mg/ml of X-gal)内孵育过夜。次日，PBS漂洗后，观察肺组织X-gal颜色后的蓝色深浅程度及范围并摄片记录。染色后的整体肺组织依次通过10%、20%和30%蔗糖溶液再次固定。随后，将肺组织包埋在OCT 复合物并在液氮中迅速冷冻成型。沿气管纵轴将肺组织切成厚度为10μm的切片;核红试剂复合染色后，可在荧光显微镜下观察摄片(200倍)。

　　1.2.5β-半乳糖酶活性测定[5]10mg肺组织在0.25mol/L Tris-HCl的均浆缓冲液中快速匀浆。200μl 邻硝基酚半乳糖甙反应底物和 900μl 含 -巯基乙醇的裂解试剂混匀后加入100 μl肺组织匀浆并孵育在37℃至产生O-硝基吡喃(ONP)，该产物可在波长420nm的分光光度仪测定。同时，以牛γ球蛋白为标准物测定肺组织均浆内的蛋白浓度，β-半乳糖酶的活性表达为单位/毫克蛋白(U/mg)。

　　1.2.6肺干/湿重比测定小鼠经苯巴比妥腹腔深度麻醉后，暴露气管并行气管插管和机械通气。开胸后，直接留取肺组织，在迅速吸收肺组织外液体后，称重后即纪录为肺湿重，并送入烘干箱内烘干，约72 h后，至反复测量肺重量无变化后，记录为肺干重。

　　1.2.7支气管肺泡盥洗液内蛋白浓度测定小鼠经气管插管收集支气管-肺泡灌洗液，收集到的灌洗液离心后取其上清液用于蛋白浓度测定，方法采用以牛γ球蛋白为标准物的蛋白浓度测定法。

　　1.3统计学分析数据表达为(x±s)。 使用美国Sigma Stat 统计分析软件用于显著性差异分析，t检验用于两组之间显著性差异统计学分析;One-way ANOVA检验用于多组之间的显著性差异统计学分析。

　　2结果

　　2.1腺病毒为载体的LacZ DNA 在肺内转染的分布及表达活性小鼠在100%O2吸入前2天经鼻腔吸入装载LacZ DNA的腺病毒,并在100%O2吸入开始时，收集标本并应用X-gal染色以了解LacZ基因在肺内转染的分布;同时，在100%O2吸入开始时及后24、48和72h分别收集肺组织以测定LacZ DNA 表达蛋白β-半乳糖酶的活性。X-gal染色结果显示LacZ DNA可在整肺和肺各级支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞的广泛转染和分布如蓝色颗粒所示(图1A、 B);LacZ DNA的蛋白表达产物β-gal的活性在100%O2吸入前即可被测出，同时，在高氧吸入24、48和72 h，β-半乳糖酶的蛋白表达活性呈现持续有效的肺内高表达(分别为3.728、4.034、3.688 U/mg)，并且，在高氧吸入后72 h，该蛋白活性的表达仍维持为高氧吸入前水平的2倍以上(表1)。表1β-半乳糖酶的活性

　　2.2 腺病毒载体在高氧性肺损伤基因治疗中的致炎作用肺干/湿重比随高氧暴露时间的延长，呈时间-依赖性升高。100%O2吸入48h后，AdLacZ组小鼠的肺干/湿重比和无治疗组小鼠相比，差异有显著性;但在继续O2吸入24h后，虽然，AdLacZ组的肺干/湿重比仍维持在较高水平，但和其他两对照组相比，差异无显著性(图2)。AdLacZ组小鼠的支气管-肺泡灌洗液内的蛋白浓度，在高氧吸入的24h和48 h，和无治疗组相比，差异有显著性;而在高氧吸入后的72 h，各组小鼠的支气管-肺泡灌洗液内的蛋白浓度的数值已基本上维持在相似的水平(图3)。图2图3

　　3讨论

　　基因治疗是21世纪新兴的分子生物学医学，它是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用,从而达到治疗疾病目的的生物医学高新技术。自1989年Rosenberg首次将基因标记导入黑色素瘤病以来，基因治疗作为治疗疾病的一种超前手段，正愈来愈受到人们的重视和关注。目前基因治疗已广泛地应用于多种遗传性疾病和后天获得性疾病的尝试性的治疗实践中， 其中全世界有四种病例已确定有肯定疗效， 即：联合免疫缺陷症(ADA)、血友病B、家族性高胆固醇血症和遗传性肺气肿[6,7 ]。基因治疗成功的关键是选用理想的基因载体， 并通过基因载体独特的基因转染性，将靶基因有效持续地转染到目标细胞DNA内，同时，该基因载体的结构设计还需最大限度地避免载体本身所引发的毒副反应的发生。目前数十种有潜力的基因载体已广泛的应用于基因治疗的动物或临床研究中[2，8]，其中腺病毒用于基因载体的研究居首位。这不仅是因为腺病毒具有很强的基因转染性，同时还具有其他载体少有的可转染大片段靶DNA的能力。虽然，腺病毒自身的病原毒副反应可引发机体炎症反应，从而限制了基因治疗的成功率，但随着对腺病毒载体结构设计改进的研究，腺病毒自身的毒副反应对基因治疗效果的影响已有了明显减少的趋势[8]。LacZ基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，1969年，美国哈佛大学以Beckwith博士为首的研究小组，应用DNA分子杂交技术首次分离到该基因。LacZ基因编码的β-半乳糖酶(简称β-gal)是由4个亚基组成的四聚体，可催化乳糖的水解，β-gal比较稳定，用X-gal为底物进行染色时，呈蓝色，便于检测和观察。LacZ基因的诸多优点使它成为基因工程实验中的一个常用标记基因[4,5]。小儿急性肺损伤(ALI)是由各种直接和间接致伤因素所导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，可造成弥漫性肺间质及肺泡水肿的病理生理改变而出现的临床综合征。随着对ALI经典的治疗方法如呼吸支持或药物治疗的改进与发展，ALI的病死率有所下降，但死亡率仍然波动在较高程度。近十几年来，尝试不同的新的研究方法以发现降低ALI病死率的有效治疗手段是科学家努力的方向[3]。在这其中，以基因治疗最有希望从遗传物质角度上根本地改变患者ALI发病的基因倾向性，从而改善ALI的严重性和预后。腺病毒载体是基因治疗中应用最广泛的载体，其介导的基因治疗在肺损伤的治疗中多有成功的报道，但腺病毒在应用于高氧性肺损伤治疗中的副作用尚未有报道，因此，本研究观察了腺病毒介导的基因治疗对高氧性肺损伤的炎症反应的影响以及其应用于ALI治疗的价值。肺拥有最庞大的上皮细胞-毛细血管网，具有独特的适合接受经鼻腔等给药的条件[9,10]。笔者应用了经鼻腔滴入装载LacZ DNA 的腺病毒制剂并观察研究了腺病毒转染LacZ DNA到肺上皮细胞的效果以及腺病毒相关的肺部炎症反应程度。 发现腺病毒可引导LacZ DNA在肺各级支气管和肺泡上皮细胞的广泛转染，并且，在高氧吸入状态下，LacZ DNA可在肺上皮细胞内高效持续表达，结果提示腺病毒为载体的基因治疗具有很强的将靶基因有效持续地转染到靶器官细胞的能力，这是将来应用腺病毒转染有益于ALI治疗基因的治疗实践成功的关键;虽然，腺病毒感染的小鼠在100%O2吸入时显示了相对增高的敏感性和肺部炎症反应，已证实肺水肿相关的指标如肺干/湿重比和支气管-肺泡内的蛋白渗出的数值,在100%O2吸入48h达高峰后于24h内迅速明显缓解,此时和其他对照组相比，腺病毒感染组的研究数值并无明显差异，这提示了腺病毒在具有很强的将靶基因有效持续地转染到细胞的能力外;其还可能引发肺部炎症反应,但这是暂时性的并可在短时间达到高峰后迅速缓解，这种致炎现象在改良腺病毒的结构DNA并去除其致炎DNA后,可能会减轻。但是，目前在评价腺病毒为载体的肺部疾病的基因治疗疗效时，应考虑腺病毒相关性致炎现象存在的可能并需加以综合分析。基因治疗作为一项全新的疾病治疗手段已经显现出强大的发展势头。近十年来，世界各国已有近400个基因治疗方案获得批准开始用于临床，“人类基因组计划”的实施以及所取得的成果，不仅使人类更加清楚地了解自身，而且为基因诊断和基因治疗的研究、开发与产业化奠定了基础。科学家乐观地估计，在21世纪的前十年将会有少数基因治疗临床试验方案取得疗效。相信， 随着载体设计和基因治疗技术的不断完善与进展，基因治疗手段必将成为解决多种遗传性疾病和后天获得性疾病的根本疗法和促进人类生活高质量化的有效保证[1,2,11]。

　　(本文彩图见封三)

【参考文献】
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　　4 Menoret S，Aubert D，Tesson L，et al. LacZ transgenic rats tolerant for β-galactosidase：recipients for gene transfer studies using LacZ as a reporter gene. Human gene therapy，2002，13(11)：1383-1390.

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　　10Vidas D，Michael M，Gokhan M，et al.Acute lung injury does not impair adenoviral- mediated gene transfer to the alveolar epithelium. Chest，2002，121(3 Suppl):33-34.

　　11Liu C，Zhang N. Nanoparticles in gene therapy principles，prospects，and challenges. Prog Mol Biol Transl Sci， 2011，104:509-562.