雌/雄激素诱导去势大鼠前列腺增生过程中间质细胞成分的动态变化

    雌/雄激素诱导去势大鼠前列腺增生过程中间质细胞成分的动态变化 (pdf) 

    【摘要】  目的  在建立雌/雄激素诱导大鼠前列腺增生动物模型的基础上，研究前列腺增生过程中间质细胞成分的动态变化。方法  对雄性Wistar大鼠施去势手术21天后，注射浓度比例为1:100的雌/雄激素，于给药第0、3、7、10、14、17和21天取材。选定前列腺指数变化最明显的时间，考察HE染色的组织切片、Vimentin和α-smooth actin(SMA)免疫组化染色等指标。结果  去势大鼠注射雌/雄激素后，前列腺指数逐渐增加，以第3和10天增加的最为明显，17天后变化趋于平缓。对3、10和21天的组织进行组织学观察。病理切片显示，在第3和10天前列腺间质成分明显增多，21天相对减少。SMA免疫组化显示，去势大鼠给药后腺泡腔外平滑肌层逐渐减少，给药10天左右接近正常，而后，又逐渐增厚。Vimentin免疫组化显示，去势后给药第3天Vimentin阳性细胞明显增多，但随着给药时间延长，阳性细胞逐渐减少。结论  雌/雄激素诱导去势大鼠前列腺增生的过程中间质细胞数量和表型有明显的动态变化，为进一步研究前列腺增生过程中病理改变和分子机制提供有益的线索。

    【关键词】  前列腺增生;雌/雄激素;间质细胞

　   Dynamic changes of stromal cells in the process of estrogen/androgen induced prostatic hyperplasia in castrated rats

    XIAO Xiang-qian，ZHOU Ying，YANG Rui，et al.Bioactive Materials Key Lab of Ministry of Education,Nankai University，Tianjin 300071, China

    【Abstract】  Objective  To investigate the dynamic changes of stromal cells in the process of estrogen/androgen induced prostatic hyperplasia (BPH) in castrated rats.Methods   Twenty-one days after castration of male Wister rats, the rats were injected subcutaneously with estrogen/androgen at a ratio of 1:100. The rats were sacraficed at 0, 3, 7, 10, 14, 17, 21, 28 days later and the prostates were subjected to prostate index (PI) analysis, hematoxylin and eosin (H&E) staining, immunohistochemistry (IHC) staining for vimentin and α-smooth muscle actin (SMA).Results   After injection with estrogen/androgen, the PI of the castrated rats were gradually increased, especially at day 3 and day 10, while PI hardly increased after day 17. H&E staining indicated that the stromal compartment was obviously increased at day 3 and day 10, while decreased after day 21. IHC staining for SMA showed that the smooth muscle cell (SMC) layer surrounding the prostate gland lumen gradually get thinned after injection, thickened as the sham-operated rats at day 10 and become more thicker thereafter. IHC staining for vimentin showed that after injection,vimentin positive cells were markedly increased at day 3, while PF decreased thereafter. Conclusion  The quantity and phenotype of stromal cells obviously changes in the process of estrogen/androgen induced benign prostatic hyperplasia in castrated rats. It may mimic the naturally-occurred physiological changes in the progress of prostate development and pathogenesis of BPH.

    【Key words】  prostatic hyperplasia (BPH); estrogen/androgen; stromal cells

    前列腺间质增生是良性前列腺增生症（Benign Prostatic Hyperplasia, BPH）的主要病理改变之一。前列腺良性增生是一种与年龄相关的进程性疾病。首先雌/雄激素比例失衡触发基底细胞的增殖和向胚胎型细胞的去分化，继而出现间质中平滑肌细胞（SMC）表型的转化和活跃增殖，而后通过上皮和间质细胞自分泌和旁分泌作用进而导致前列腺间质增生［1,2］。前列腺间质细胞主要包括SMC和成纤维细胞。我们的前期工作实验结果证明，雌二醇可明显促进人前列腺SMC特异蛋白的表达［3］，而SMC的过度增殖是前列腺间质增生的主要病理改变之一。

    以往的研究大多用正常与增生的前列腺组织进行对照，很少有针对BPH过程中间质细胞成分变化的研究。本研究在建立雌/雄激素诱导大鼠前列腺间质增生动物模型的基础上，观察大鼠BPH的过程中间质细胞成分的动态变化，进一步阐明BPH发生和发展的分子机制。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料

    1.1.1  实验动物  体重为250～300g的成年雄性Wistar大鼠。由北京维通利华实验动物公司提供。

    1.1.2  主要试剂  丙酸睾酮注射液（25mg/ml），批号0406171，苯甲酸雌二醇注射液（1mg/ml），批号0401141，均由天津金耀氨基酸有限公司生产。以玉米油配制雌/雄激素比例为100：10000μg/ml的混合液。小鼠抗人α-smooth muscle-actin(SMA)抗体为sigma产品。小鼠抗人Vimentin抗体购于博士德公司。

    1.2  实验方法

    1.2.1  实验动物的处理  取40只大鼠施去势手术作为实验组，12只大鼠施假手术作为正常对照组。21天后，实验组皮下注射浓度比例为1:100的雌/雄激素，正常对照组注射玉米油0.1ml/只，于给药第0、3、7、10、14、17和21天取材，5只/次，正常对照组每周取材1次，3只/次。称大鼠体重和前列腺湿重, 计算前列腺指数，将标本以10％福尔马林固定，石蜡包埋，用于HE染色和免疫组化的观察。

    1.2.2  前列腺指数（prostatic index，PI）的计算

    PI=前列腺湿重(g)/体重(g)×100％。

    1.2.3  免疫组化  将石蜡包埋的组织切片在梯度酒精中水化，以0.3％的过氧化氢和10％血清分别处理10min和30min，随后滴加一抗（1：600的SMA或1：200的Vimentin），于室温孵育2h；生物素标记的马抗小鼠IgG(1:200)，37℃孵育30min；辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素（1：200），37℃孵育30min。以二氨基联苯胺（DAB）为显色底物。

    1.3  统计学方法  以SPSS11.0对数据进行单因素方差分析，结果以 ±s表示。

    2  结果

    2.1  前列腺指数的变化  与正常组比较，大鼠去势后3周（即给药0天）前列腺指数明显降低，注射雌/雄激素后，前列腺指数逐渐增加，以第3和10天增加的最为明显，第7天增长速度略有下降，第10天与正常组差异无显著性（P>0.05），第17～21天PI达到峰值，明显高于正常对照组（P<0.05，见表1，2；图1）。 表1  雌/雄激素诱导去势大鼠BPH过程中前列腺指数的变化  （略）表2  雌/雄激素诱导去势大鼠BPH过程中前列腺指数变化的组间比较  （略）过程中PI的动态变化2.2  病理分析  HE染色的病理切片显示，去势后的大鼠前列腺均出现萎缩，腺上皮细胞呈扁平状，腺泡腔明显缩小，分泌物极少，腺泡数目减少，间质成分相对增加。给药第3天，腺泡数目明显增加，腺泡腔扩大，分泌物增多。随着给药时间的延长，上皮细胞由扁平状逐渐变为立方状、柱状，甚至出现假复层；腺泡腔也逐渐扩大，分泌物增加，甚至潴留，分泌物由稀薄变得浓稠，但间质成分所占的比例相对减少（图2：A1,B1,C1,D1,E1）。

    2.3  免疫组化  SMA的免疫组化结果显示，去势大鼠前列腺组织间质中SMC缩短，细胞表面有棘突伸出，腺泡腔外包绕的平滑肌层明显增厚；给药第3天，SMC形态有所改善，细胞伸长，SMC成分仍然较多；随着给药时间的延长，SMC形态逐渐趋于正常，呈长梭形，棘突消失，包绕在腺泡腔外的平滑肌层逐渐减少，在10天左右接近正常，21天又增厚（图2：A2,B2,C2,D2,E2）。

    Vimentin的免疫组化结果显示，在正常前列腺组织中Vimentin阳性染色细胞很少。在去势后给药第3天的组织中Vimentin阳性染色的细胞明显增多，但随着给药时间的延长，逐渐减少，在21天的前列腺组织中阳性染色的细胞很少（图2：A3,B3,C3,D3,E3）。（本文图2见封三）

    3  讨论

    前列腺间质增生是一种与年龄相关的进程性疾病。老年男性体内雌/雄激素比例失衡引起的前列腺上皮和间质细胞自分泌和旁分泌作用程序性时空变化可能是BPH的重要诱因之一。本实验采用与老年男性体内雌/雄激素接近的比例诱导去势大鼠发生前列腺间质增生，并在给药不同时间对间质细胞成分的动态变化进行研究。

    实验结果显示，去势大鼠皮下注射雌/雄激素后，前列腺指数总体上呈升高趋势，在给药第3和10天前列腺指数增加较快，第10天与正常组比较差异无显著性；在给药第17和21天的前列腺指数达到峰值。病理切片和免疫组化的结果表明，去势大鼠在给药第3天上皮细胞增生明显，形态由扁平变为接近正常的立方状，腺泡数目、腺泡腔大小和分泌物均明显增加，而间质成分所占的比例无明显改变，SMA染色阳性的SMC形态虽然有所改善，但是并未完全恢复正常。提示SMC的组织形态学的改变滞后于上皮细胞。

    正常大鼠前列腺中SMC（SMA阳性，Vimentin阴性）包绕于腺泡周围，成纤维细胞（SMA阴性，Vimentin阳性）位于腺泡之间的间质部分。而在大鼠去势后及给药第3天，位于腺泡之间的细胞表现出SMA和Vimentin染色均为阳性，可能为具有增殖活性的肌成纤维细胞（或增殖型SMC），尤其在给药后3天，肌成纤维细胞数目最多，且免疫组化染色的颜色最深。随着给药时间的延长，SMA和Vimentin阳性染色的细胞逐渐减少，在第10天左右SMC层接近正常，但至21天，SMC层明显增厚，而此时Vimentin阳性染色的细胞较少。

    肌成纤维细胞（myofibroblast）代表了成纤维细胞和SMC的中间状态［4］。测定肌成纤维细胞很困难，因为它们来源不同，并且无特异性标记蛋白。在对心血管细胞的研究中发现［5,6］，在胚胎发育期的瓣膜、二尖瓣黏液瘤、短期肺动脉瓣向主动脉瓣的自体移植以及体外的组织工程瓣膜中，瓣膜间质细胞表现为Vimentin、SMA和SMemb阳性，在正常成年人心脏瓣膜、长期的自体移植瓣膜和组织工程瓣膜中，间质细胞仅Vimentin呈阳性表达。体外实验表明［7］，机械负荷使心脏的成纤维细胞（Vimentin阳性）通过MAPK途径转化为肌成纤维细胞（Vimentin和SMA均阳性）。在缺血再灌注的心脏细胞中［8］，肌成纤维细胞表达Vimentin，但是myosin、calponin和desmin均为阴性。说明肌成纤维细胞是具有增殖活性的细胞，与胚胎期和疾病过程中SMC的增殖有关。

    大鼠去势后给药第10天，前列腺指数和包绕于腺泡腔外的SMA阳性染色的平滑肌细胞层厚度均接近于正常组，因此在这段时间可能是萎缩的前列腺再发育的过程，而后可能是BPH的发生和发展过程。发育过程中间质变化最明显的是给药第3天，增生过程中间质变化最明显的是给药第10天，推测，前列腺的发育和增生的主要变化发生在早期。

    本实验研究雌/雄激素诱导去势大鼠BPH的过程中，间质细胞数量和表型的动态改变，为进一步研究BPH过程中相关基因的时空变化，揭示BPH的病理改变和分子机制提供有益的线索。

    【参考文献】

    1  Salm SN,Koikawa Y,Ogilvie V, et al. Transforming growth factor-beta is an autocrine mitogen for a novel androgen-responsive murine prostatic smooth muscle cell line, PSMC1.J Cell physiol,2000, 185(3):416-424.

    2  Mariani S,Salvatori L,Basciani S, et al. Expression and cellular localization of follicle-stimulating hormone receptor in normal human prostate, benign prostatic hyperplasia and prostate cancer.J Urol, 2006, 175(6):2072-2077; discussion 2077.

    3  Zhang J,Hess WM,Thurnher M,et al. Human prostatic smooth muscle cells in culture: estradiol enhances expression of smooth muscle cell-specific markers.Prostate, 1997,30(2): 117-129.

    4  Powell DW, Mifflin RC, Valentich JD, et al. Myofibroblasts, I:paracrine cells important in health and disease. Am J Physiol,1999, 277:1-19.

    5  Rabkin E, Aikawa M, Stone JR,et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation,2001, 104: 2525-2532.

    6  Rabkin-Aikawa E,Farber M,Aikawa M,et al. Dynamic and reversible changes of interstitial cell phenotype during remodeling of cardiac valves.J Heart Valve Dis,2004, 13(5):841-847.

    7  Wang J, Chen H, Seth A, et al. Mechanical force regulation of myofibroblast differentiation in cardiac fibroblasts. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2003, 285:1871-1881.

    8  Frangogiannis NG,Michael LH,Entman ML.Myofibroblasts in reperfused myocardial infarcts express the embryonic form of smooth muscle myosin heavy chain (SMemb). Cardiovasc Res,2000, 48(1):89-100.

    *基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:30471733,30672101,30600218),天津市社发处一般项目基金(编号:06YFSYSF02000),留学人员短期回国工作讲学项目(“两个基地”项目编号：30410403237）

    作者单位：1 300071 天津，南开大学生命科学学院生物化学与分子生物学系，生物活性材料教育部重点实验室（Δ责任作者）

    2 300193 天津,天津中医药大学针灸推拿系

　(编辑：守  中)