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【摘要】 目的 探讨低分子量肝素（lowmolecular weight heparin，LMWH）对重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）大鼠胰腺微循环的影响。方法 SD大鼠制备重症急性胰腺炎，成模后随机分为3组:（1）假手术组（对照组，S）;（2）SAP组;（3）LMWH治疗组。检测SAP组术后1天，LMWH治疗后1天及对照组的血清淀粉酶、ET-1、TNF-α、胰腺组织电镜以及3天动物存活率。结果 与对照组比较，SAP组淀粉酶、ET-1、TNF-α显著升高（P值均<0.001），LMWH治疗后，其淀粉酶、ET-1、TNF-α较SAP组均显著降低（P值分别为<0.001，<0.01，<0.001）。电镜下，SAP组微血管内有血栓形成，LMWH治疗后微血栓减少。SAP组3天存活率为25.0%（2/8），显著低于S组（100.0%，8/8）（P<0.05）和LMWH治疗组（87.5%，7/8）（P<0.05）。结论 LMWH治疗能降低ET-1和TNF-α升高的幅度，抑制胰腺微血栓的形成，改善胰腺微循环障碍，从而减轻胰腺坏死和提高动物生存率。
关键词 胰腺炎药物疗法 肝素 低分子量治疗应用 微循环 胰腺/病理学 坏死
Effect of low molecular weight heparin on pancreatic microcirculation
in severe acute pancreatitis in rats
Qiu Fu，Lv Xinsheng，Fan Qinqiao，et al.
Department of General Surgery，Xiangya Hospital，Central South University，Changsha410008.
【Abstract】 Objective To investigate the effects of lowmolecular weight heparin（LMWH）on pancreatic miˉcrocirculation in severe acute pancreatits（SAP）in rats.Methods SD rats were randomly divided into3groups:（1）Sham operation（S）group;（2）SAP group;（3）LMWH treatment（LT）group.The concentrations of serum amylase，tuˉmor necrosis factorα（TNF-α），endothelin-1（ET-1），pancreaticultrastructure were measured at1d after models was set up in SAP，1d after LT in LT group and in S group.Results Compared with S group，the serum amylase，ET-1，TNF-αin SAP group were significantly increased（P<0.001）;After LMWH treatment，the serum amylase，ET-1，TNF-αdecreased significantly compared with SAP group（P<0.001，<0.01，<0.001respectively）.On elecˉtronicoscopy，the microthrombosis in LT group was obviously less than that in SAP group.The3d survival rate in SAP group（25.0%）was significantly lower than that in S group（100.0%，P<0.05）and in LT group（87.5%，P<0.05）.Conclusion The results suggest that LMWH can improve the survival rate of SAP which might be related to the improvement of the pancreatic microcirculation by down-regulate the levels of serum ET-1and TNF-α.
Key words pancreatitis drug therapy heparin low molecular weight therapeuticuse microcirculation pancreas pathology necrosis
重症急性胰腺炎（Severe Acute Pancreatitis，SAP）病情危重，发展快，严重威胁患者生命，其死亡率现仍高达20%～40%。微循环障碍是急性胰腺炎的启动因子和持续损害因子 ［1］ ，改善胰腺微循环能减轻胰腺的炎症程度，降低死亡率 ［2］ 。低分子量肝素（low molecular weight heparin，LMWH）比普通肝素抗血栓能力强，出血危险小，我科采用LMWH治疗SAP的临床和实验研究取得了一定的疗效 ［3］ ，但是对其治疗机理尚不清楚。本研究旨在通过动物实验，明确其是否通过改善胰腺微循环达到治疗SAP的效果。
1 材料与方法
1.1 模型制备 采用250～300g健康雄性SD大鼠64只（中南大学湘雅医学院实验动物中心提供）作为实验对象，术前禁食24h，皮下注射庆大霉素生理盐水3ml/kg（16万U/500ml）。予3%戊巴比妥钠（30mg/kg）腹腔注射麻醉，75%酒精消毒术野后正中切口进腹。开腹后，于肝十二指肠韧带下方找到胆胰管，用银夹夹闭其上端，再从十二指肠内侧找到胆胰管并插入直径1mm硅胶管，经此管注入5%牛磺胆酸钠（1ml/kg，购自美国Sigma公司），速度0.2ml/min，2min后松开银夹，约10min后即可见胰腺有多个出血点，表明制作重症急性胰腺炎模型成功，逐层间断关腹后于背部皮下注射生理盐水20ml/kg。术后给予皮下注射庆大霉素生理盐水3ml·kg -1 ·12h -1 （16万U/500ml）和生理盐水80ml·kg -1 ·d -1 。
1.2 实验动物分组 大鼠随机分为3组:（1）假手术（S）组:16只，只进行麻醉及开腹。（2）重症急性胰腺炎（SAP）组:24只。（3）LMWH治疗（LT）组:24只，制作重症急性胰腺炎模型后4h给予低分子量肝素（100U/kg，1次/12h，购自杭州九源基因有限公司）皮下注射。S组和SAP组在术后1天，LT组在LMWH治疗后1天，经下腔静脉采集血标本和采取胰腺组织。
1.3 观察项目
1.3.1 血清淀粉酶 采用日立7170A全自动生化分析仪测定。
1.3.2 血清TNF-α检测 采用ELISA法检测（试剂盒购自北京晶美生物工程有限公司）。
1.3.3 血清ET-1检测 采用ELISA法检测（试剂盒购自美国Cayman公司）。
1.3.4 胰组织学检查 在坏死组织与相对正常组织交接处取胰腺标本，H-600日产透射电镜下观察胰腺组织超微结构改变。
1.3.5 存活率观察 每组8只，观察3天动物存活情况。
1.4 统计学方法 计量资料用均数±标准差（ˉx±s）表示，组间差异采用ANOVA及q检验分析。存活率采用χ 2 检验。P<0.05认为统计学上有显著意义，统计学处理采用 SPSS10.0软件。
2 结果
2.1 动物存活率 S组第1天、2天、3天存活率均为100.0%（8/8）;SAP组第1天、2天、3天存活率分别为75%（6/8）、62.5%（5/8）和25.0%（2/8）;LT组第1天、2天、3天存活率均为87.5%（7/8）。第1天、2天SAP组存活率与LT组和S组比较差异无显著性（均P>0.05）;第3天SAP组存活率显著低于LT组和S组（P<0.05），LT组和S组差异无显著性（P>0.05）。见表1。
2.2 血清淀粉酶浓度 SAP组淀粉酶显著高于S组和LT组（P<0.001），LT组显著高于S组（P<0.05）。见表1。
2.3 血清ET-1浓度 SAP组ET-1显著高于S组和LT组（分别P<0.001，P<0.01），LT组和S组差异无显著性（P>0.05）。见表1。
2.4 血清TNF-α浓度 SAP组TNF-α显著高于S组和LT组（P均<0.001），LT组和S组差异无显著性（P>0.05）。见表1。
表1 各组血清ET-1（pg/ml）、TNF-α（pg/ml）、淀粉酶（U/L）及动物1～3天存活率比较
注: 1） 与S组比较P<0.001， 2） 与LT组比较P<0.001， 3） 与LT组比较P<0.05， 4） 与S组和LT组比较P<0.05， 5） 与S组比较P<0.05
2.5 电镜检查 S组微血管结构正常，无血栓形成（图1）;SAP组微血管内有血栓形成，血管内皮细胞脱落、细胞膜结构不完整（图2）;LT组微血管内血栓变小、呈多个碎片，血管内皮细胞肿胀、细胞膜结构完整（图3）。
图1 S组胰腺微血管结构正常，无血栓形成 ×5000
图2 SAP组胰腺微血管内有血栓（thromb）形成，血管内皮细胞（VEC）脱落、细胞膜结构不完整 ×6000
图3 LT组胰腺微血管微血栓（thromb）变小， 呈多个碎片;血管内皮细胞（VEC）肿胀、细胞膜结构完整 ×6000
3 讨论
抗细胞因子治疗SAP微循环的研究近年较多，如TNF多克隆抗体