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关键词 海马 DNA RNA 激光扫描共聚焦显微镜 氯氮平
Effects on DNA，RNA meatabolism in hippocampal CA3pyramidalneurons of
clozaping rats，studied by laser scanning confocal microscopy
Yin Bin，Chen Yaowen，Xu Hong，et al
Department of Neurology，the Second Affiliated Hospital of Shantou University，Shantou515041.
【Abstract】 Objective To explore effects on DNA，RNA metabolism in rat hippocampus CA3pyramidal neuˉrons by clozapine.Methods Twenty-four Sprangue-Dawley rats were divided into test and control group，clozapine was given to test group rats intraperitoneally for7days，then LSCM was used to investigate the DNA，RNA change in rats brains slice hippocampus of test and control group.Results The fluorescence pixels of DNA/RNA of average foreground hippocampus CA3pyramidal neurons by clozapine rats was2.684±0.605，The fluorescence pixels of DNA/RNA of average foreground hippocampus CA3pyramidal neurons by clozapine rats was2.954±1.059，There was no significant difference in two groups（P>0.05）.Conclusion It is suggested that clozapine can’t change DNA，RNA in rat hippocampus CA3pyramidal neurons.
Key words hippocampus DNA RNA LSCM clozapine
研究表明，海马在学习和记忆等活动中起着重要作用。随着研究范围的扩大，脑薄片标本不再仅限于用来进行神经生理学的研究，而且还用在神经药理、神经生化等神经科学的多个研究领域 ［1，2］ 。近年来，中枢神经阻滞剂对病人认知功能的影响逐渐引起临床的重视，而对这些病人的临床研究的干扰因素太多。本文旨在通过使用大鼠海马脑薄片标本，用acridine orange（AO）荧光探针对细胞核进行荧光染色，用激光共聚焦显微镜技术 ［3］ ，以期了解氯氮平对海马CA3区锥体细胞内核酸代谢的影响，为今后临床研究奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验动物、试剂及试验仪器 本试验采用10～15天龄SD大鼠24只，雌雄不拘，实验动物由汕头大学医学院动物中心提供。湖南洞庭制药厂提供氯氮平粉。美国产AˉCASUltima-321型激光共聚焦显微镜系统（Meridian Inc）。美国产WSZ-286-82解剖显微镜。上海产FA1604电子天平。
1.2 实验方法
1.2.1 实验动物分组及动物模型建立 24只10～15天龄SD大鼠随机分成两组，给12只大鼠腹腔注射0.02mg/ml的氯氮平溶液（由湖南洞庭制药厂提供氯氮平粉）1ml（氯氮平组），给12只大鼠腹腔注射生理盐水1ml（对照组），均注射7天，1天2次，后断头取海马标本。
1.2.2 海马脑片的制备 为降低脑代谢率，于实验前将动物置于冰水中降温直至四肢运动消失、角膜变成白色、仅有微弱呼吸时，迅速断头取脑，常规切取左侧脑半球，细心剔出海马标本。用手控切刀沿海马槽走向连续切取厚400μm的脑片4片，并用特制毛刷将脑片小心移入盛有被混合气饱和冷冻（95%O 2 和5%CO 2 ）的当天新鲜配制的人工脑脊液（ACSF）中。将脑片移入一特制培养皿中，培养皿容积为400μl继续通以混合气，加入4μl0.1%AO染料（Arcridine Orange，吖啶橙，Sigma公司）在室温下染色1h。
1.2.3 用激光扫描共聚焦显微镜获取连续共聚焦图像 将染色后的脑片用混合气饱和的ACSF冲洗3遍，静置片刻使其贴附于培养皿底，保持湿润状态。在继续通以混合气条件下，将样品放在激光扫描共聚焦显微镜的载物台上，在倒置显微镜下寻找待重建的目标，然后转到激光光源进行预扫描，确定最佳的扫描参数，再将聚焦平面移到待扫目标的底部，最后由计算机沿Z轴方向按设定的步距作连续切片扫描。计算机将获得的一系列横截面图像，自动贮存到Bernoulli磁盘或硬盘中，待进一步处理。
1.3 图像分析与数据处理 ACAS Ultima-312型激光扫描共聚焦显微镜系统含有图像处理系统。试验结果用SPSS10.0统计软件分析，结果的数据以ˉx±s表示，采用独立样本t检验对两组间均数进行比较。
2 结果
由于荧光染料AO是双重染色探针，可同时染色组织中的DNA和RNA两种成份，激光激发后，经两个检测器（PMT1和PMT2）分别接收不同波的发射光，即图像上分别显示的绿色和红色，分别代表DNA和RNA两种成份，黄色则是两种成份按一定比例合成。为避免每次实验时由于染色等因素可能造成的误差，本实验将每一标本的DNA和RNA荧光染色像素之比进行统计比较，结果发现氯氮平组大鼠海马脑片DNA和RNA的荧光像素之比为1.6634±0.27062，而对照组大鼠海马脑片DNA和RNA的荧光像素之比为1.78758±0.57085，两组间无统计学差异（t=0.766，P=0.454>0.05）。
3 讨论
近年来，中枢神经阻滞剂对病人认知功能的影响逐渐引起临床的重视。中枢神经阻滞剂能阻断中脑皮质DA传导，对认知可产生负面影响，其本身抗胆碱能作用应用于抗帕金森病，对学习、记忆和其它认知功能极为不利。大量事实表明，在学习和记忆过程中，伴随有脑内核酸、蛋白质和多糖等多种生物大分子的合成增多，其间必然涉及多种基因的表达 ［4］ 。由于海马在人类记忆缺失上关系密切，而它的解剖位置和纤维联系的特点，提示它可能在脑功能中起着关键作用，故在研究脑的学习和记忆的功能上，海马是一个重点，加上它具有片层组织结构，结构相对较简单，是一个很适用的研究模型，因而对它的研究一直是热点［1，2］ 。郭沈昌，殷彬等研究发现氯氮平对鼠脑海马记忆长时程增强（LTP）现象有影响，提示该种抗精神病药对学习、记忆等认知功能有 一定的影响 ［5］ 。马光瑜等报道用激光共聚焦显微镜观察吗啡成瘾对大鼠海马锥体神经细胞内DNA、RNA的影响 ［6］ ，但迄今为止，尚无用激光共聚焦显微镜对使用抗精神病药后大鼠海马CA3区锥体神经细胞的DNA和RNA进行研究的报道。本文利用acridine orange（AO）荧光探针对细胞核进行荧光染色，并根据DNA和RNA分子大小和构型的不同，在完全相同的条件下，使DNA发出黄绿色或绿色荧光，使RNA发出橙色或红色荧光，用激光共聚焦显微镜技术 ［7］ ，以期发现氯氮平大鼠海马CA3区锥体细胞内DNA和RNA的变化，以了解氯氮平对海马内核酸代谢的影响。实验结果表明氯氮平组和对照组大鼠海马脑片DNA和RNA的荧光像素无统计学差异。但大量的研究表明特定功能的改变必然有其物质基础，我们将进一步研究海马其它区域核酸代谢情况，以期发现影响学习和记忆的客观依据。
参考文献
1 Bliss T V P，Collingridge G L.A synaptic model of memory:long-term potentiation in the hippocampus.Nature，1993，361:31-39.
2 韩太真.长时程增强现象的研究.生理科学进展，1990，21:76-77.
3 陈耀文.激光扫描共聚焦显微镜三维重建花粉的组织结构.中国体视学与图像分析，1997，2（4）:223:225.
4 许昭纷.神经生物学.第三版.上海:上海医科大学出版社，1999，386-480.
5 郭沈昌，殷彬.利培酮和氯氮平对鼠脑海马切片长时程增强的研究.中华精神科杂志，2001，34（3）:156.
6 马光瑜，樊小力.用激光共聚焦显微镜观察吗啡成瘾对大鼠海马锥体神经细胞内DNA、RNA的影响.神经解剖学杂志，2000，16（2）:113-115.
7 李楠.激光扫描国家级显微术.北京:人民军医出版社，1997，5-7.
作者单位:515041广东汕头大学医学院第二附属医院神经内科
广东汕头大学医学院中心实验室