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关键词 2-氯化腺苷 癫痫 凋亡 淋巴细胞 大鼠
The influence of2-CAdo on early apoptotic lymphocyte in peripheral blood of convulsion rats Wu Chunyan，Zhang Aiqi，Li Jing，et al.
Daqing Oil Field General Hospital Pediatrics163001.
【Abstract】 Objective To explore the influence of2-CAdo on early apoptotic lymphocyte in peripheral blood of convulsion rats.Methods The epilepsy model was established by injecting coriaria lactone（CL）into Wistar rats to induce the generalized seizures.Thirty rats were randomly divided into three groups，group A:epilepsy;group B:CL plus2-CAdo;group C:CL plus normal saline（NS）.The percentage of early apoptotic lymphocyte in peripheral blood was detected with flow cytome
try.Results 1.the percentage of apoptotic lymphocyte in peripheral blood after convulsion was lower than that of the before convulsion rats at6h，12h，24h（P<0.01）.2.The percentage of apoptotic lymphocyte in group2-CAdo was higher than those of other groups（P<0.01）.Conclusion 2-CAdo might inˉduce lymphocyte apoptosis in peripheral blood of convulsion rats.
Key words 2-chloroadenosine epilepsy apoptosis lymphocyte rat
癫痫是由多因素引起的一组慢性脑病综合征。目前大多数学者认为神经免疫调节网络失衡参与了癫痫的发展过程。在复杂的神经网络中，神经系统与免疫系统存在双向调节作用，前者通过产生多种神经递质调节免疫功能，后者通过产生细胞因子等免疫活性物质调节神经功能 ［1］ 。腺苷作为神经保护性递质对神经元有抑制作用，还可抑制兴奋性氨基酸的释放，抑制氧自由基的产生，抑制一氧化氮的作用，具有神经保护 ［2］ 和抗惊厥作用 ［3］ 。但目前关于腺苷与外周血淋巴细胞早期凋亡的关系尚无报道。本研究通过腺苷受体激动剂2-氯化腺苷（2-Chloroadenosine，2-CAdo）在大鼠癫痫模型中研究对外周血淋巴细胞早期凋亡的影响，以进一步探讨腺苷对癫痫神经免疫网络中的作用。
1 材料与方法
1.1 动物分组 健康成年Wistar大鼠30只，体重200～250g，雌雄各半，由哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心提供。动物随机分为3组;A组:致痫组10只，B组:致痫+2-CAdo组10只，C组:致痫+生理盐水组10只。
1.2 动物模型及实验方法 马桑内酯（由哈尔滨医科大学药理学部提供）A，B，C组按1.5mg/kg，腹腔注射，全部大鼠于注射后5min左右出现抽搐，持续时间约1min左右。B组于马桑内酯注射前1h及抽搐后1h分别经尾静脉注射2-CAdo（由ICN公司提供）剂量为0.6mg/kg，C组于马桑内酯注射前1h及抽搐后1h经尾静脉注射等量的生理盐水。3组大鼠均于致痫前，致痫后6h，12h，24h予以戊巴比妥钠麻醉（1%，40mg/kg，腹腔注射），经股静脉抽出1ml静脉血放入抗凝管中。
1.3 流式细胞术检测淋巴细胞早期凋亡 抗凝外周血1ml 冷用PBS3倍稀释，加入淋巴细胞分离液面上，2000γ/min，离心15min，吸取单个核细胞层。冷PBS洗涤，1000γ/min，离心5min弃血清;加入Buffer调细胞浓度为2～5×10 6 /ml;吸取50μl细胞悬液加Annexin-V，PI50μl（Annexin-V，PI试剂盒由北京宝赛生物技术有限公司提供），避光室温25min，FACSort流式细胞仪（美国BD公司出品）检测，结果采用CELLQUEST3.0软件分析。
1.4 统计学方法 各组淋巴细胞凋亡率均采用均值±标准差（ˉx±s）表示，采用SPSS统计软件处理。
2 结果
2.1 流式细胞仪检测外周血早期凋亡淋巴细胞 Annexin V能与早期凋亡细胞的磷脂酰丝氨酸高亲和力特异性综合，而PI染色能够红染凋亡晚期的细胞和死细胞得以从中区别开来。见图1:早期凋亡细胞二维散点图:根据阴性对照所设定的荧光正常界限，将淋巴细胞分为正常活细胞（荧光双阴性细胞，左下象限），早期凋亡细胞Annexin V（+），PI（-），右下象限）及死细胞（Annexin V（+），PI（+），右下象限）。利用CellQuest软件进行参数获取和数据分析结果。图1
2.2 癫痫前后各组大鼠外周血淋巴细胞凋亡率 癫痫发作后6h即可见凋亡细胞数改变，A，B，C组在癫痫后6h较癫痫发作前凋亡细胞数减少，组内两个时间点相比较差异有非常显著性（P<0.01）。在12h及24h其凋亡细胞数逐渐减少。B组凋亡细胞数在致痫前与A，C组相比差异无显著性（P>0.05），而致痫后6h，12h，24h与A，C组各相应时间点相比较凋亡细胞数明显减少，组间两两比较差异有非常显著性（P<0.01）。而A组与C组各相应时间点比较差异无显著性（P>0.05）。见表1。
表1 惊厥发作前后大鼠外周血淋巴细胞凋亡率 （略）
3 讨论
细胞凋亡又称程序性死亡，是机体基本生理功能，存在于生命的全过程，是维持机体正常生理功能和自身稳定的重要机制，生理状态下的凋亡在病理状态下的加剧是促使某些疾病进一步发生，发展的重要因素 ［4］ 。目前癫痫后细胞凋亡的存在国内外学者已从形态学、生化、分子生物学及相关基因表达各方面取得了大量的证据。但有关癫痫与外周血淋巴细胞早期凋亡的关系以及给予2-CAdo后对其外周血淋巴细胞早期凋亡的关系尚无报道。我们应用AnnexˉinV和PI双标记法 ［5］ 对马桑内酯致痫大鼠检测外周血淋巴细胞早期凋亡。AnnexinV和PI双标记法是一种比较新颖的方法，其应用目前国内还刚开始。我们对致痫大鼠致病前，致痫后6h，12h，24h外周血淋巴细胞早期凋亡进行检测的结果是致痫后6h外周血凋亡细胞已可见减少，之后逐渐减少，到24h凋亡细胞显著减少，不同时间点相比较差异有显著性（P<0.05）。表明癫痫后6h即早期已有外周血淋巴细胞凋亡参与其发病，到24h淋巴细胞凋亡数仍有变化。 说明癫痫后早期外周血淋巴细胞凋亡在淋巴细胞的发育和癫痫免疫调节中发挥重要作用。其机制可能是:在癫痫发作时淋巴细胞抑制凋亡基因活性增强，淋巴细胞bcl-2基因过度表达，可能通过抑制或延迟细胞凋亡，处进多克隆B细胞增强，从而产生大量自身抗脑抗体如神经节苷脂抗体，谷氨酸受体自身抗体，谷氨酸脱羧酶自身抗体等，而这些抗体引起癫痫的发生和发展过程。
我们在实验中B组给予2-CAdo后在致痫6h，12h，24h早期淋巴细胞数较A组各个相应时间点相比较明显增高（P<0.05），而C组给予生理盐水组凋亡细胞数与A组各相应时间点相比较差异无显著性（P>0.05），这一结果表明2-CAdo有诱导致痫后外周血淋巴细胞凋亡。腺苷是中枢神经系统一种抑制性神经调质，在大脑的能量贮存及能量需求之间提供信号，使之达到一种平衡。腺苷对神经元有抑制作用，还可抑制兴奋性氨基酸的释放，抑制氧自由基的产生，抑制一氧化氮的作用，具有神经保护作用，腺苷不仅对正常的中枢神经元有抑制作用，而且有抗惊厥作用。但2-CAdo能够诱导致痫大鼠外周血淋巴细胞凋亡机制尚不清楚，考虑神经免疫网络系统中细胞因子水平有关。刘智胜 ［6］ 等研究结果发现癫痫患儿血清TNF-α水平明显高于正常对照组，表明癫痫体内免疫细胞处于活化状态，细胞因子TNF-α参与了癫痫患儿的异常免疫应答，推测癫痫患儿的细胞因子网络失衡致细胞免疫功能紊乱，高水平的细胞因子参与了癫痫的放电过程。2-CAdo则通过激活与Gs蛋白相偶联的腺苷受体，活化AC，使细胞内CAMP含量增量，达到抑制TNF-α表达的作用，亦可在翻译前水平发挥作用而抑制TNF-α的表达。而TNF-α具有抑制淋巴细胞凋亡的作用。本项研究结果揭示2-CAdo通过诱导外周血淋巴细胞早期凋亡来参与癫痫的免疫学机制，为临床上治疗癫痫提供新的思路。
参考文献
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6 刘智胜，杨立志，王芳琳，等.癫痫患儿的血清细胞因子水平变化及意义.中国神经免疫学和神经病学杂志，2002，9（3）:132-134.
作者单位:1163001黑龙江大庆油田总医院儿科
2150086哈尔滨医科大学附属第二医院儿内科