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关键词 地花菌素 抗氧化 大鼠 脂质过氧化 超氧化物歧化酶 自由基 1，1-二苯基-2-苦基肼 肝匀浆
The antioxidative effect of albaconol from albatrellus confluens Yang Weimin，Liu Jikai，Ding Zhihui，et al.
Yunnan Pharmacological Laboratories of Natural Products， Kunming Medical College，Kunming650031.
【Abstract】 Objective In order to evaluate the antioxidative activity of a novel compound albaconol isloated from Albatrellus confluens in vitro.Methods The rat liver homogenate lipid peroxidation inhibitory activity，superoxˉide dismutase（SOD）activity，and1，1-dipheny-2-picrylhydraxyl（DPPH）free radical scavenging activity were inˉvestiagted.Results Albaconol inhibited lipid peroxidation in rat liver homogenate with IC 50 values of104.2μg/ml compared with butylated hydroxyanisole（BHA.IC 50 40.4μg/ml）and vitamine E（VE，IC 50 127.2μg/ml）.Albaconol increased SOD activity with EC 50 values of106.3μg/ml，and BHA（EC 50 76.4μg/ml）as control.It scavenged DPPH radical scavenging with EC 50 values of51.9μg/ml，compared with control BHA（EC 50 19.9μg/ml）.Conclusion The results suggested the albaconol possessed antioxidative activity due to its effect on the antioxidant enzyme SOD and proton-donating action.
Key words albaconol antioxidative activity rat lipid peroxidation superoxide dismutase 1，1-dipheny-2-picrylhydrazyl liver homogenate
自由基（Free radical，FR）是指带有不配对电子的分子、原子团或基团，包括氧自由基、氮自由基等，其中与医学关系密切的是氧自由基（OFR，也称活性氧），主要包括超氧阴离子和羟自由基。在正常生活状况下，人体内不断进行氧化反应而生成自由基，同时自由基也不断被体内的防御系统清除，因此自由基在体内保持一种低浓度的动态平衡。如果体内自由基产生过多或清除自由基能力下降则会损伤体内生物大分子，破坏细胞结构与功能，促进疾病的发生发展。这种防治体内自由基产生过多和清除自由基的能力称为抗氧化作用。由于体内获得电子的过程大多数发生在氧原子或氧分子上，因此在代谢过程中产生的自由基多数为氧自由基 ［1，2］ 。
FR检测方法分直接检测法与间接检测法。直接检测法目前只有电子自旋共振（ESR）技术，但仪器昂贵，就用受限。目前一般通过检测FR的相关酶（如SOD、CAT、GSH-Px）或FR代谢产物（如脂质过氧化产物MDA）间接检测FR水平 ［3］ 。众所周知，自由基与众多不同类型疾病病理过程有关，例如心肌缺血、脑缺血、动脉粥样硬化、糖尿病、炎症、肿瘤初始期及衰老等 ［1～3］ 。这些疾病可被自由基清除剂等抗氧化物质所改善，因此抗氧化物质一直受到关注，包括真菌来源的天然抗氧化化合物 ［4～6］ 。 地花菌素（图1），是本研究组成员从非食用云南产地花菌Albatrellus confluens中提取到的新骨架类型化合物，属于scutigeral类似物，scutigeral被报道是无香草基团的VR激动剂，已有报道证明其具有镇痛作用 ［6～8］ 。本文重点研究地花菌素的抗氧化活性。
图1 地花菌素分子结构
1 材料与方法
1.1 动物 雌性SD大鼠，体重200～250g，由昆明医学院动物科提供。
1.2 药物 地花菌素来源同前述 ［7］ 。硫代巴比妥酸（TBA）、1，1-二苯酸-2-苦基肼（DPPH）、黄嘌吟、黄嘌呤氧化酶由Sigma公司提供。其他试剂均为分析纯级。地花菌素溶于二甲亚砜（DMSO）中。
1.3 大鼠肝匀浆制备 参照文献方法制备大鼠肝匀浆 ［8］ 。肝脏取出后迅速置于冰生理盐水（NS）中冷存，将其经门静脉灌注冰0.86%NS清洗，然后用匀浆器制备匀浆，1g肝组织加入9ml0.86%NaCl溶液。经3000g，10min离心后取上清液即为10%大鼠肝匀浆。
1.4 脂质过氧化水平测定 采用改进硫代巴比妥酸法（TBA法）测定脂质过氧化代谢产物丙二醛（MDA），从而评价脂质过氧化反应水平 ［8，9］ 。在试管中加入6mM抗坏血酸（60μl），5%大鼠肝匀浆（4.0mg蛋白质/ml，600μl），30μl受试药溶液，通过加入4mM FeCl 3 （30μl）启动脂质过氧化反应。反应液置于37℃恒温水浴30min，加入20%三氟醋酸（TCA，500μl）终止反应。然后经3500g，10min离心，取出上清液（1ml），加入0.67%（W/V）TBA（500μl）混合，于沸水中加热10min。冷却后，于紫外-可见分光光度计测定532nm波长下的吸收度值。脂质过氧化抑制率按下列公式计算:［1-（T-B）/（C-B）］×100%，其中T、C、B分别为受试药管、溶媒对照管及未经脂质过氧化反应（反应零点）对照管吸收度值。
1.5 SOD活性测定 采用黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统产生超氧阴离子，氧化羟胺产生亚硝酸盐，后者在对氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈紫红色 ［10，11］ 。在试管中加入下列试剂:50mM磷酸盐缓冲液（pH7.8，250μl），纯水（100μl），10mM盐酸羟胺（25μl），7.5mM黄嘌呤（25μl），23.4U/ml黄嘌呤氧化酶（25μl），1%肝匀浆（0.8mg蛋白质/ml，10μl）及25μl受试药。经37℃恒温水浴30min，加入3.3g/L对氨基苯磺酸（250μl）及10g/L甲萘胺（250μl）。测定550nm波长下吸收度值。SOD活性按下列公式计算:［1-（T-B）/（C-B）/AC］×100%，其中T、C、B分别为受试药管、溶媒对照管及反应零点对照管吸收度值。
1.6 DPPH自由基清除活性测定 参照文献报道方法 ［12，13］ 。于试管中加入受试药DMSO溶液（20μl）及150μM DPPH乙醇溶液（980μl），混匀。于室温下放置30min后测定517nm波长下吸收度值。DPPH自由基清除活性按下列公式计算:［1-（Ai-Aj）］×100%，其中Ai，Aj，Ac分别为受试药管、受试药对照管（含受试药及乙醇，但不含DPPH）及DPPH对照管（含DPPH及DMSO，但不含受试药）吸收度值。1.7 统计学方法 数据表示为平均值±S.E.M。IC 50 及EC 50 按非线性回归方法计算。
2 实验结果
2.1 地花菌素抑制大鼠肝匀浆脂质过氧化反应 地花菌素抑制大鼠肝匀浆中非酶性Fe 2+ -抗坏血酸系统诱导的脂质过氧化反应，IC 50 及95%可信限为104.2（71.5～154.7）μg/ml，而阳性对照BHA及VitE IC 50 及95%可信限为40.4（27.1～58.9）、127.2（92.2～15
7.7）μg/ml。（图2）
2.2 地花菌素增强大鼠肝匀浆SOD酶活性 地花菌素具有提高SOD活性，清除超氧阴离子自由基作用，其EC 50 及 95%可信限为106.3（87.4～129.3）μg/ml，而BHA（阳性对照）为76.4（68.4～85.4）μg/ml（图3）。
图2 地花菌素对大鼠肝匀浆脂质过氧化反应的抑制作用
◆地花菌素，ˇVitE，O BHA。数据表示为ˉx±s.E.M.n=6。地花菌素、VitE、BHA抑制脂质过氧化反应IC 50 值分别为104.2，127.2，40.4μg/ml。
图3 地花菌素增强大鼠肝匀浆SOD酶活性
◆地花菌素，O BHA。数据表示为ˉx±s.E.M.n=6。地花菌素、BHA提高SOD酶活性的EC 50 值分别为106.3，76.4μg/ml。
2.3 地花菌素清除DPPH自由基作用 地花菌素具有一定的DPPH自由基清除作用，其EC 50 及95%可信限为51.9（27.3～68.8）μg/ml，而阳性对照BHA为19.9（9.8～33.3）μg/ml（图4）。DPPH自由基清除属自由基质子型清除，是众多抗氧化机制中的一种。
图4 地花菌素清除DPPH自由基活性
◆地花菌素，O BHA。数据表示为ˉx±s.E.M.n=6。地花菌素、BHA清除DPPH自由基活性的EC 50 值分别为51.9，19.9μg/ml。
3 结论
本研究证明地花菌素具有较强的抑制脂质过氧化活性，增强SOD活性，以及一定的DPPH自由基清除活性。如果提示地花菌素通过提高抗氧化酶活性有质子-供体机制，从而具有清除自由基的抗氧化活性。而地花菌素的抗氧化作用可能与其在动物体内的生物活性有关。
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作者单位:1650031云南昆明昆明医学院云南省天然药物药理重点实验室
2650204云南昆明中国科学院昆明植物所