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radiotherapy trimodalities on C57BL mice with Lewis lung cancer
Zhang Hongtao，You Qingshan，Wang Ruizhi
Department of Radiotherapy，Affiliated Hospital of Oncology，Harbin Medical University，Harbin150040.
【Abstract】 Objective To assess the antitumor value of hyperthermia，hydroxycamptothecine（HCPT），and raˉdiotherapy on C57BL mice with Liwis lung cancer.Methods （1）Tumor Growth Delay（TGD）were analysised at difˉferent groups.Results （1）The TGD obtained at41℃，42℃，43℃hyperthermia were respectively1.07，1.40，2.52days.（2）The TGD acquired at41℃，42℃，43℃thermo-chemothrapy were respectively4.86，5.57，7.14days，and were all prolonged.（3）The TGD acquired at41，42，43℃thermo-radiothrapy were respectively7.71，8.43，8.82days，were totally longer than single radiotherapy group.（4）The TGD of11.01，13.07，15.195days of groups of combined treatment of the TGD acquired at41，42，43℃thermo-chemo-radiothrapy respectively，were all raised than any modalities.Conclusion （1）The effect of hyperthermia increased when temperature was raised.（2）Hyperˉthermia enhanced the effect of HCPT and radiation.（3）The effect of thermo-chemo-radiothrapy significantly raised compared with the effect of single therapy or modalities.
Key words hyperthermia hydroxycamptothecine radiotherapy tumor growth delay（TD） Lewis lung canˉcer
恶性肿瘤是当前危害人类健康和生命的主要疾病之一，多种疗法对敏感肿瘤取得了较好的疗效，但对于不敏感肿瘤，如非小细胞肺癌，单一疗法疗效不佳，有报道热疗联合放疗、化疗能够提高肿瘤的缓解率及治愈率，细胞和动物实验也证实了这一点。本实验旨在研究热疗、化疗、放疗联合应用对肿瘤的作用及其机理。
1 材料与方法
1.1 实验材料 采用C57BL小鼠，雌雄各半，平均体重20g，小鼠来源为中国医学科学院医学实验研究所实验动物繁育场。肿瘤采用Lewis肺癌瘤株，药物采用黄石飞云制药厂生产的羟基喜树碱（HCPT）。放疗机为瑞典ELEKTA公司制造5605型电子直线加速器，加温采用北京医疗设备厂生产的WC-501型电热水浴箱。
1.2 实验方法 把C57BL小鼠随机分组，雌雄各半，每组7～10只。荷Lewis肺癌小鼠购于中国医学科学院药物研究所，待肿瘤长至1cm 3 ，断髓处死小鼠，在无菌条件下取出皮下肿瘤，制成单细胞悬液，用1ml注射器吸取该悬液含2×10 6 个肿瘤细胞，注射至每只小鼠大腿背侧皮下，待肿瘤长至1cm 3 进入实验。用生理盐水稀
释HCPT至0.25mg/ml，每只鼠按体重腹腔注射给药。小鼠采用戊巴比妥钠麻醉。按每公斤体重腹腔注射给药40mg。应用水浴箱加热，使小鼠荷瘤后肢肿瘤完全浸入水中2～3mm，温度精确到0.1℃，水浴温度高于所需热疗温度0.2℃～0.3℃，以确保肿瘤内部达到所需温度，加热30min。采用直线加速器，4MV-X线，源皮距100cm，照射野大小为10cm 2 ，小鼠麻醉后将荷瘤后肢放入照射野内，加组织填充，每次3Gy，连续1周，共5次，剂量为15Gy。每周测量3次2个相互重直的肿瘤半径，肿瘤体积用V=4πr 3 /3计算，V为肿瘤体积，r为肿瘤2个垂直半径的
平均值，实验终止采用肿瘤生长延迟（TGD）的指标进行观察:即小鼠死亡或动物肿瘤的体积达到治疗前体积的5倍（T 5 ）。各组除非特殊说明，均为热化放疗连续进行，没有时间间隔，顺序为放疗+热疗/热化疗。HCPT在热疗前15min给药，以保证热化疗同时进行。
2 结果
2.1 热疗与HCPT化疗联合对荷Lewis肺癌的C57BL小鼠的作用
2.1.1 HCPT对荷Lewis肺癌的C57BL小鼠的作用 HCPT化疗的疗效随剂量增高而增高，1、2、4mg/kg各组的TGD分别为1.87、4.00、4.57天，均明显优于不加处理的对照组（P<0.05、0.001、0.001）。2、4mg/kg HCPT化疗组的TGD明显优于1mg/kg组（P<0.05、P<0.01），虽然4mg/kg化疗组的TGD高于2mg/kg HCPT化疗组，但无统计学差异（P>0.05）。各化疗组之间有明显差异（方差分析P<0.05），见表1。
表1 不同剂量HCPT对Lewis肺癌的作用略
2.1.2 单独热疗对荷Lewis肺癌的C57BL小鼠的作用 热疗对C57BL小鼠的Lewis肺癌的抑制作用随温度的增加而增高，41℃、42℃、43℃热疗的TGD分别为1.07、1.40、2.52天，43℃热疗与对照组相比明显抑制Lewis肺癌的增长（P<0.002），但41℃、42℃热疗对Lewis肺癌的作用与对照组比较无明显差异（P>0.05），43℃热疗明显优于41℃热疗（P<0.05），但43℃热疗比42℃热疗TGD延长，但无统计学意义。见表2。
表2 不同温度对小鼠Lewis肺癌作用略
2.1.3 热疗与HCPT化疗联合对荷Lewis肺癌的C57BL小鼠的作用 热疗增加HCPT的抗肿瘤作用随温度的增加而增高，41℃、42℃、43℃热疗与HCPT化疗组的TGD分别为4.86、5.57、7.14天，42℃、43℃热疗与HCPT化疗组明显优于单纯HCPT化疗组（P<0.05、P<0.002），41℃热疗与HCPT化疗组与单纯HCPT化疗无明显差别（P>0.05），43℃热疗与HCPT（2mg/kg）化疗组的疗效明显优于41℃、42℃热疗与HCPT化疗组（P<0.01、P<0.05）。41℃、42℃、43℃热化疗各组之间有明显差异（方差分析P<0.05），见表3。
表3 热疗与HCPT化疗联合对Lewis肺癌作用试验组 略
2.2 热疗对放疗的增强作用 42℃、43℃热放疗组对Lewis肺癌的作用明显优于单纯放疗组（P<0.05，P<0.01）41℃、42℃、43℃热放疗联合的TGD分别为7.71、8.43、8.82天，41℃热放组的TGD虽然长于单放组，但无统计学差异（P>0.05），随着温度的增高，热放疗的TGD逐渐增长，但41℃、42℃、43℃热放疗联合各组间并无明显差异（方差分析P>0.05）。见表4。
表4 热疗与放疗联合对Lewis肺癌作用略
2.3 热疗、化疗、放疗三联综合治疗Lewis肺癌的作用
2.3.1 不同温度热疗、化疗、放疗三联治疗的影响 热放化疗三联的疗效明显优于各二联组，41℃热化放疗的疗效也优于所有二联治疗，41℃、42℃、43℃热化放疗联合应用对Lewis肺癌的TGD分别为11.07、13.01、15.195天。41℃、42℃、43℃热化放疗联合应用均明显优于相同温度的热放疗和热化疗，P值均<0.001，41℃、42℃、43℃热化放疗联合应用的疗效随着热疗温度的增高而增高。见图1。
图1 温度对热化疗、热放疗及热放化疗的影响略
2.3.2 热放化疗三联治疗与放化疗对Lewis肺癌疗效的比较 41℃、42℃、43℃热化放疗联合应用对Lewis肺癌的疗效明显优于放化组（P<0.05，P<0.001，P<0.001）。见表5。
表5 热放化疗三联治疗与放化疗对Lewis 肺癌疗效的比较略
3 讨论
自1971年发现拓扑异构酶（TOPO）以来，人们对其进行了积极的研究，至今只发现几种药物影响TOPO-I，喜树碱就是其中之一，HCPT是一种喜树碱的类似物，它可选择性的抑制TOPO-I，从而干扰DNA的复制，特异作用于细胞周期的S期 ［1，2］ 。许多喜树碱类似物已经开始应用于临床，如CPT-11，Topotacan等。本实验中，HCPT对Lewis肺癌的抑制作用随剂量的增加而增加，但是尽管HCPT4mg/kg化疗组的TGD高于2mg/kg化疗组，但并无统计学差异，说明单纯增加HCPT剂量并不能取得更大的疗效。
1866年W.Busch首次提出，在正常组织可以忍受的高温条件下，41℃～45℃温度热疗可以杀死肿瘤细胞，1989年Overgaard提出热疗做为单一的治疗手段对肿瘤没有明显的疗效 ［3］ 。在我们的实验中，随着热疗温度的增高，对Lewis肺癌的疗效增加，但只有43℃时热疗疗效才明显优于对照组，对肿瘤有明显的抑制作用。而在临床上很难实现这一温度，人们开始研究热疗与化疗、放疗的综合治疗。Overgarrd等通过生物学的研究表明热疗能导致哺乳动物细胞和动物以及人类肿瘤的致死性破坏，也能增加一些化疗药物的疗效 ［4］ 。
Hahn1979年根据实验报道了许多临床上使用的药物，在温度升高时明显增加对细胞的细胞毒作用 ［4］ ，在本实验中，41℃热疗与化疗联合应用对肿瘤的抑制作用与对照组无明显差异，而42℃、43℃热化疗组优于对照组，43℃热化疗明显优于41℃、42℃热化疗。从中可以看出热疗明显增加了HCPT的抗肿瘤作用，41℃、42℃、43℃热化疗各组之间有明显的差别，41℃热化疗疗效就已增高，其作用随热疗温度的增高而增高，并无温度阈值，说明如果热疗与羟基喜树碱联合应用，要达到更好的疗效，就必须增加热疗的温度。
Overgaard和Horsman1992年提出，热疗和放疗联合应用产生附加的甚至合成的作用，可能是由于导致细胞的放射敏感性增加 ［5］ 。Oleson指出许多应用热疗进行放射增敏的实验取得了较好的放射增敏作用，提出热疗导致的放射增敏是通过改善血流和乏氧细胞的再氧合实现的，而不是直接的细胞毒作用 ［6］ 。Song提出中等温度热疗通过增加再氧合增加放疗疗效，这时热疗主要目的或许是一种调整，代替高温热疗杀伤细胞 ［7］ 。在本实验中，虽然随着温度增加，热放疗组的TGD逐渐增加，但41℃、42℃、43℃热放疗各组间并无明
显差别（P>0.05），说明热疗增加放疗的疗效并不是热的细胞毒作用，主要是一种调节，主要通过两方面实现，一是热疗增加肿瘤血流，从而增加肿瘤细胞的再氧合。 人类肿瘤中有一部分乏氧细胞，其对放射的抵抗是氧合细胞的3倍，Song等研究显示在41.5℃～43.5℃、30min热疗，明显增加R3230AC肿瘤的氧分压，而且42.5℃、30min热疗明显增加R3230AC肿瘤的血流，说明这一结果主要是增加肿瘤血流所致 ［8］ 。二是抑制肿瘤细胞的亚致死性损伤的修复，许多研究表明，亚致死性损伤和潜在致死性损伤在细胞对放射的反应受放射损伤修复中起重要作用，许多研究都直接用评价修复的抑制作为加强放射疗效的一种方法来改善疗效，Raphorst发现热疗抑制亚致死性损伤和潜在致死性损伤的修复，说明热疗可以通过抑制这些修复，导致很大幅度增加放射敏感性，而且对放疗抗拒的细胞就是由于细胞对放射损伤修复能力增加，从而抑制这种损伤的修复就可以增加细胞的放射敏感性 ［9］ 。综上所述，热疗对放疗的联合作用除了抑制放射损伤的修复外，中等温度热疗小于43℃是通过增加肿瘤血流改善氧合，增加放疗疗效，而高温热疗大于43℃与放疗联合应用导致放射增敏是由于热疗的细胞毒作用减少肿瘤血供和细胞氧消耗来实现的。在本实验中，无论41℃、42℃、43℃热放疗时，对荷Lewis肺癌的C57BL小鼠的疗效明显优于单纯放疗组。尽管41℃、42℃、43℃热放疗疗效随温度增高而增高，但各组并无明显差别，41℃热放疗疗效较低的主要原因可能是由于加温温度较低，只有增加肿瘤的氧合而没有热疗的细胞毒作用，而42℃、43℃热放疗由于既可以增加肿瘤的氧合，还可以通过细胞毒作用杀伤肿瘤细胞。
Herman提出，临床上应用化放疗的目的在于，化疗是放疗的重要辅助手段，可以控制肿瘤的远处播散 ［10］ 。但化疗对放疗局部作用的增加与否取决于多种因素，如细胞周期的再分布，亚致死性损伤的修复等。Overgaard认为局部热疗虽然单独应用疗效不佳，但可增加肿瘤细胞对放疗、化疗的敏感性，增加肿瘤的局控率 ［3］ 。许多研究已经表明，热疗、化疗、放疗三联治疗疗效明显优于二联治疗，Cividalli应用三联治疗（放疗、紫杉醇、43℃热疗）在实验中取得了最大增强率达3.8 ［11］ 。关于热疗、化疗、放疗联合的作用机理，还需要进一步研究，有人认为热疗也许是增加药物的摄取，从而增加对放疗产生的亚致死性损伤的修复。1988年，Herman首次证明联合放疗、热疗和细胞毒药物（顺铂）具有潜在的增效作用，而且是通过热疗和顺铂抑制亚致死性损伤修复来实现的 ［12］ 。Raaphorst在对顺铂和放射敏感和不敏感的人卵巢癌细胞系的研究认为:可以确定中等温度热疗+顺铂与分次放射联合能抑制放射产生的亚致死性损伤的修复，无论单纯热疗还是单纯化疗（顺铂），既不能有效的放射增敏，也不能对亚致死性损伤修复进行有效的抑制，但联合热化疗却可以很好的放射增敏和有效的抑制亚致死性损伤的修复 ［9，13］ 。
HCPT是一种很有前途的药物，特异作用于TOTP-I，且特异作用于S期，而且热疗也主要作用S期，所以热疗和HCPT可能具有合成的杀伤作用，前面的实验也证实了热疗增加HCPT的作用，S期细胞对放射抵制，而且热化疗可以抑制放射产生的亚致死性损伤的修复，这样，三者的联合应用明显提高了对肿瘤细胞的杀伤作用。在本实验中，41℃、42℃、43℃热化放疗联合应用均明显优于相同温度的热化疗、热放疗。而且随着热疗温度的增高疗效增高，15.195天，明显高于43℃热化疗、43℃热放疗、化放疗二联组的7.14、8.82、9.28天。甚至41℃热放化组的TGD为11.01天，也明显高于各二联组。从中我们可以得出，热化放疗三联应用的作用明显优于任意两者联合。
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作者单位:150040哈尔滨医科大学附属肿瘤医院放疗科