照射时间延长对小鼠Lewis肺癌MMP9和Ecad表达影响

【摘要】  　　目的 模拟调强适形放射治疗(IMRT)照射模式，观察照射时间延长对小鼠Lewis肺癌细胞转移相关基因基质金属蛋白酶9（MMP9）及E钙黏附素（Ecad）表达的影响。方法 荷Lewis肺癌C57BL/6雄性小鼠40只,随机分成4组:假照组、常规照射组(A组)、IMRT模拟1组(Bl组)、IMRT模拟2组（B2组），各10只。A、B1、B2组照射剂量均为15 Gy，24 h 后脱颈处死全部小鼠，用免疫组化法测细胞转移相关基因MMP9及Ecad的表达。结果 与假照组比较，A、B1、B2组MMP9表达阳性率降低，Ecad表达阳性率升高，差异均有显著性(F=210.207、102.059,q=8.393～33.921， P<0.01)；与A组比较，B1、B2组的MMP9表达阳性率降低，Ecad表达阳性率升高，差异均有显著性(q=8.376～15.897，P<0.01)；与B1组比较，B2组MMP9表达阳性率降低，Ecad表达阳性率升高，差异均有显著性(q=2.957、4.044，P<0.05)。结论 在一定的范围内，照射时间延长可致MMP9表达升高，Ecad表达降低。

【关键词】  放射疗法,调强适形　肺肿瘤　明胶酶B　E钙黏附素

　　EFFECT OF PROLONGED RADIOTHERAPY ON EXPRESSION OF MMP9 AND Ecad OF Lewis PULMONARY CARCINOMA IN MOUSE

　　ZHANG YELING, YU HONGSHENG, LIU XIGUANG

　　 (Department of Oncology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China);

　　［ABSTRACT］ Objective To investigate the effects of prolonged delivery time of intensitymodulated radiotherapy (IMRT) on the expressions of MMP9 and Ecadherin of Lewis pulmonary carcinoma in mouse. Methods Forty male Lewislungcancer(C57BL/ 6)bearing mice were equally randomized to four groups: shamradiotherapy group (SR group),conventional radiotherapy group (group A) and two modeling IMRT groups (group B1 and group B2). The mice in groups A, B1 and B2 were irradiated with 6 MV Xrays at a dose of 15 Gy and all the mice were killed 24 hours later.  The expressions of MMP9 and Ecadherin in tumor tissues were examined immunohistochemically.  Results Compared with SR group, the expressions of MMP9 in groups A, B1 and B2 decreased, that of Ecadherin increased (F=210.207,102.059;q=8.393-33.921;P<0.01). Compared with group A, the expressions of MMP9 in groups B1 and B2 decreased,while that of Ecadherin increased (q=8.376-15.897,P<0.01). Compared with group B1, expression of MMP9 in group B2 decreased, and that of Ecadherin increased (q=2.957,4.044;P<0.05). Conclusion Under given conditions, extention of exposure time may result in increasiong of expression of MMP9 and decreasing of expression of Ecadherin.

　　［KEY WORDS］ radiotherapy, intensitymodulated; lung neoplasms; gelatinase B; Ecadherin
   
　　放射治疗是肿瘤综合治疗的主要手段之一，调强适形放射治疗(IMRT)在提高肿瘤靶区剂量分布的同时使正常组织保持低剂量分布，因此在临床上得到了广泛地应用。然而在适形放疗中，为达到物理剂量分布的适形性要求，物理师会根据具体情况设置若干子野，在照射实施过程中，这些子野的照射是分步进行的，既有先后顺序又有不同的强度，这样做的结果是使某一既定照射剂量的完成时间延长，照射时间延长可影响IMRT的有效性。本实验采用模拟IMRT照射模式，观察照射时间延长对小鼠Lewis肺癌转移相关基因基质金属蛋白酶9（MMP9）及E钙黏附素（Ecad)表达的影响，初步探讨其可能的机制。

　　1  材料和方法

　　1.1  实验动物和瘤株
   
　　C57BL/6 小鼠90只，清洁级，4～6周龄，雄性，体质量18～22 g，由中国医学科学院实验动物研究所提供。小鼠购进后在我院医学动物实验中心饲养。饲养条件为：室温22～ 28 ℃，相对湿度40%～ 70%，标准颗粒饲料喂养。

　　1.2  实验方法

　　1.2.1  荷瘤小鼠模型的制备 

　　将种鼠断颈处死后，在无菌条件下分离出生长良好的肿瘤组织，用生理盐水洗净血性物后，用天平称质量。剪碎后按1 g肿瘤组织加入生理盐水3 mL的比例，研磨成匀浆后经200目筛网过滤，4 g/L台盼蓝染色。活细胞拒染，死细胞则被染成蓝色。显微镜下计数活细胞数，用生理盐水稀释为2.8×109/L，制成瘤细胞悬液，将0.2 mL的瘤细胞悬液接种到健康小鼠右腹股沟皮下。接种后1 周左右，肿瘤体积为(0.65±0.01) cm3，用于实验。

　　1.2.2  实验分组 

　　荷Lewis肺癌的C57BL/6 雄性小鼠40只随机分成4组，假照组、常规照射组（A组）、IMRT模拟1组（B1组）、IMRT模拟2组(B2组）,每组10只。

　　1.2.3  照射方法 

　　将各组小鼠(包括假照组小鼠) 用100 g/L水合氯醛（350 mg/ kg）经腹腔麻醉后，用胶布固定在固定板上，记号笔标出小鼠肿瘤体表定位，在瘤体上放1 cm厚凡士林纱布补偿，用美国Varian 23EX直线加速器产生的6 MVX 线垂直照射靶区，源皮距(SSD)为100 cm，剂量率为6 Gy/min，其照射野均为2.0 cm×2.0 cm，总照射剂量为15 Gy，小鼠均在清醒状态下照射。假照组不照射。A组:常规照射，每次2 min，分3次，总时间6 min；B1组：按物理师的设计要求对各个照射剂量点进行照射，每个剂量点分5 次照射，其间间隔7 min，照射总时间30 min；B2组：按物理师的设计要求对各个照射剂量点进行照射，每个剂量点分5 次照射，其间间隔10.5 min，照射总时间45 min。照射后的小鼠分组用小鼠笼携回动物房喂养， 24 h后全部脱颈处死，取出肿瘤迅速用40 g/L中性缓冲甲醛溶液进行固定。

　　1.3  MMP9与Ecad表达的检测
   
　　采用免疫组化PV 6001法。将组织标本用流水冲洗4 h后放入自动脱水机脱水，石蜡包埋，切片后放入60 ℃温箱过夜。切片脱蜡水化,微波修复抗原,滴加一抗，置37 ℃水浴箱孵育1 h；滴加二抗,37 ℃水浴箱孵育20 min。DAB显色，苏木精复染，二甲苯透明，中性树胶封片，40倍显微镜下观察。MMP9阳性表达为瘤细胞胞浆内出现棕黄色颗粒沉淀，Ecad阳性表达为瘤细胞胞膜上出现棕黄色颗粒。根据胞浆、胞膜着色的程度分级：（-）为无着色，（±）为浅黄色，（+）为棕黄色，（）为深棕黄色，（）为棕褐色；阳性表达为（+）～（）。每张切片随机选取5个高倍视野，每个视野计数100个瘤细胞，计算阳性细胞占瘤细胞总数的百分率。

　　1.4  统计学处理
   
　　采用SPSS 11.5 及PPMS 1.5[1]统计学软件进行数据处理，结果均用±s表示，数据间比较采用单因素方差分析。

　　2  结果
   
　　与假照组比较，A、B1、B2组MMP9表达阳性率降低，Ecad表达阳性率升高，差异均有显著意义(F=210.207、102.059,q=8.393～33.921，P<0.01)；与A组比较，B1、B2组的MMP9表达阳性率降低，Ecad表达阳性率升高，差异均有显著意义(q=8.376～15.897，P<0.01)；与B1组比较，B2组MMP9表达阳性率降低，Ecad表达阳性率升高，差异均有显著性(q=2.957、4.044，P<0.05)。见表1。表1  各组Lewis肺癌组织细胞的MMP9、Ecad表达阳性率比较（略）

　　3  讨论

　　IMRT技术的优势集中体现在对靶区的精确定位及完美适形上，这种“精确和完美”是通过不断改变射束方向、移动床角、增加子野数量来实现的。一般较简单的IMRT约有20个子野，平均7个方向射束，每个方向射束2～3个子野，使用静态多叶光栅调强技术单次剂量输出时间约需15 min，断层扫描式调强放射治疗所需时间和靶区长度呈正相关，如果计划中加上3～4次床角转动，以上照射方式单次剂量输出时间都将延长至15～30 min[2]，子野数多者有报道为50～60 个[3]，这将使单次剂量输出时间延长更多。以上数据显示，IMRT单次剂量输出时间超过30 min在临床上已是很普遍的事情。常规放疗多采用2～3野，完成1次吸收量为2 Gy的照射最多需5 min。由于加速器的剂量输出率不变，时间延长将使单位时间内组织的吸收剂量降低，可以理解为相对剂量率的下降。传统的外照射放射生物学理论及临床经验都是基于较少的照射野、较短的治疗时间、较高的剂量率上所建立的，而 IMRT 单次剂量输出时间超过30 min的平均剂量率不到常规放疗的20%，其剂量率的降低可能对放射生物效应产生一定程度的影响，影响的程度则与组织细胞对辐射反应内在的生物学机制密切相关。李晓丽等[4]的研究表明，随着照射时间延长，小鼠Lewis肺癌细胞Bax表达降低，而Bcl2表达升高，凋亡指数下降。照射时间延长可导致高能X线对小鼠Lewis肺癌杀伤作用增强。齐鲁医学杂志2010年4月第25卷第２期  Med J Qilu, April 2010, Vol.25, No.２
   
　　细胞黏附和基质降解是肿瘤转移中的两个重要环节。肿瘤细胞黏附其他肿瘤细胞、宿主细胞或细胞外基质成分的能力直接影响其侵袭和转移。钙黏蛋白(cad) 是一组Ca2+依赖性跨膜糖蛋白，它在胚胎发育、形态学发生以及成年组织中上皮极性和完整性的维持等方面起着重要的作用。相邻细胞间Ecad 胞外区交错排列形成反向平行二聚体，成为“拉链”式结构，使相邻同种上皮细胞紧密黏附在一起，胞浆区通过连环素(catenin)与细胞骨架相连，从而正常发挥Ecad 的功能。肿瘤细胞Ecad表达降低，细胞黏附性降低，瘤细胞易从实体瘤上脱落下来，使瘤细胞具有侵袭转移性。大量临床研究资料证明，多种肿瘤Ecad表达减弱，且与肿瘤的转移显著相关。因此，检测Ecad的表达有助于对肿瘤生物学行为的了解。
   
　　MMPs是一类Zn2+依赖的细胞外蛋白水解酶，可降解基底膜（ECM）的所有成分。大量研究表明，MMPs对肿瘤侵袭和转移起重要作用，其中最重要的是MMP2、MMP9和MMP3。在肿瘤的侵袭过程中，肿瘤细胞与ECM表面的整合素受体及各种非整合素受体结合，如层粘连蛋白、纤连蛋白等，结合后的肿瘤细胞直接分泌MMP或诱导宿主细胞产生MMP，局部降解ECM，肿瘤细胞沿着降解破坏的ECM向周围组织侵袭和转移。SHOU等[5]的研究表明，非小细胞肺癌中MMP9表达与局部浸润、淋巴结情况、分期有关。孙迪文等[6]实验研究表明，肺癌病人MMP2的表达强度随组织学分级的升高而增加，淋巴结有转移组MMP2表达强度显著高于淋巴结无转移组。
   
　　本文研究模拟IMRT的照射时间模式，采用延长5.0倍（B1组）和7.5倍（B2组）的时间实施照射，结果表明，相同剂量的照射、不同的照射时间模式对Lewis肺癌细胞MMP9及Ecad表达的影响有明显差异。照射组与假照组相比，MMP9的表达均降低，而Ecad的表达均增高。说明Lewis肺癌细胞接受6 MVX 线照射后，其侵袭转移能力下降。照射时间延长5.0倍组和7.5倍组与常规照射组相比，MMP9表达均增高，而Ecad的表达均降低。而且，随着照射时间延长，MMP9有升高趋势，Ecad有降低趋势。
   
　　IMRT在物理学上的优势是显而易见的，但是延长了相同剂量的照射完成时间，降低了相对剂量率，抑制瘤细胞转移的生物效应比常规照射有所下降， 因此，临床实施IMRT时应考虑到照射时间延长的因素，降低因照射时间延长对疗效的影响。

【参考文献】
  　　[1]周晓彬,纪新强,徐莉. PPMS 1.5统计软件的功能及其应用[J]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(1):9193.

　　[2]VERHEY L J. Physical considerations in the use of intensity modulated radiotherapy to produce three dimensional conformal dose distributions[J]. J Jpn Soc Ther Radiol Oncol, 2000,12:191193.

　　[3]CHANG S X, CULLIP T J, DESCHESNE K M. Intensity modulation delivery techniques: “step & shoot” mlC autosequence versus the use of a modulator[J]. Med Phys, 2000,27:948949.

　　[4]李晓丽,刘希光,程熙国,等. 照射时间延长对小鼠Lewis肺癌细胞杀伤作用影响[J]. 齐鲁医学杂志, 2008,23(3):195197.

　　[5]SHOU Y, HIRANO T, GONG Y, et al. Influence of angiogenetic factors and matrix metalloproteinases upon tumor progression in nonsmall cell lung cancer [J]. Bri J Cancer, 2001,85(11):17061712.

　　[6]孙迪文,项锋钢,梁超群. 肺癌VEGF和MMP2的表达与临床病理特征的关系[J]. 青岛大学医学院学报, 2004,40(1):4446.