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Binzhou Medical College，Binzhou256603，China.
【Abstract】 Objective To investigate the inhibiting effect of salvianolic-acid B（SA-B）on a nontumorigenic hu-man prostatic epithelial cell line.Methods By variable cellular biological techniques including light microscopy，cell counting-trypan blue staining，MTT method and flow cytometer.Results Light microscopy reveals the BPH1-C5treated cells polymorphism;Cell counting-trypan blue staining and MTT results show the treated cells viabilities in-duced;Flow cytometer reveals the BPH1-C5treated cells underwent apoptosis.Conclusion The BPH1-C5cells treated with salvianolic-acid B underwent the morphological and functional alterations including apoptosis and necrosis.
【Key words】 salvianolic-acid B;prostatic tumor;apoptosis
丹酚酸B（Salvianolic acid B）是丹参有效水溶性成分中含量最高、活性最强的一种，其抑制肝纤维化、降血脂、抗氧化、保护心脑血管等多种药理活性 ［1～4］ 已为人所知，笔者在研究丹酚酸B的药效过程中意外发现其有明显的抗前列腺肿瘤的作用。
1 资料与方法
1.1 药物与试剂 丹酚酸B购自上海天甲生物有限公司，前列腺肿瘤细胞株BPH1-C5细胞由Howard大学Xinbin Gu惠赠，1640培养液购自GiBco公司，噻唑蓝（MTT）购自Sigma公司。FASCalibur流式细胞仪购自美国BD公司，酶标仪购自上海雷勃分析仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 光镜观察细胞形态的变化 将细胞接种于96孔板，选取实验组、对照组各6孔，丹酚酸B作用时间分别为6、12、24h，预定时间倒置显微镜下观察摄影。
1.2.2 台盼蓝拒染法计数活细胞 将细胞接种于24孔板，选取实验组对照组各4孔，丹酚酸B作用时间为3、6、12、24h，预定时间台盼蓝染色，计数板上计数。
1.2.3 MTT测定细胞活力 将细胞接种于96孔板，选取实验组、对照组细胞各6孔，丹酚酸B作用时间分别为3、6、12、24h，预定时间加入MTT染料，4h后吸弃上述溶液，加入100μl的DMSO，室温30min，酶标仪上570nm处测定OD值。
1.2.4 流式细胞仪检测细胞死亡方式 将细胞接种于6孔板，选取实验组、对照组各3孔，丹酚酸B作用时间分别为12、24、48h，到预定时间胰酶消化细胞制成细胞悬液，经1%Triton x-100和0.01%RNase处理，0.5%PI染色，上机检测。
2 结果
2.1 光镜观察结果 正常培养条件下的BPH1-C5细胞为饱满的多边形，近似圆形，突起较少，胞体透亮，胞内颗粒较少，细胞均匀铺满生长在96孔板底，生长状态良好。丹酚酸B作用6h后，细胞成堆分散生长在96孔板底，细胞形态变得模糊。丹酚酸B作用12h后，细胞形态不完整，胞体逐渐减小，胞体内颗粒逐渐增多，有死亡细胞，丹酚酸B作用24h后，见大多数细胞死亡，见图1。
2.2 台盼蓝拒染计数结果 正常培养的细胞出现台盼蓝阳性染色细胞较少，丹酚酸B作用6h后，见细胞死亡;24h，台盼蓝阳性染色细胞的比率达到45.5%，数据来自三组独立的实验，卡方检验结果P<0.01，见表1。
表1 台盼蓝染色活细胞计数（略）
注: * P<0.01
2.3 MTT检测结果 随着药物作用时间延长，细胞活力逐渐减少，见图2，P<0.01。
图2 MTT检测细胞活力（略）
2.4 流式细胞仪检测凋亡峰 丹酚酸B作用12、24、48h细胞的亚二倍体率分别为46.23%、57.87%和11.18%，形成明显的凋亡峰，见图3 （图1、3见封三）（略）。
3 讨论
丹酚酸B是丹参有效水溶性成份中含量最高、活性最强的一种，对心脑血管、肝、肾等疾病的疗效确切，但丹酚酸B的抗肿瘤作用未见报道。Tang M等曾报道丹酚酸B能抑制β淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）对PC12细胞的毒性作用 ［5］ ，本文的研究表明丹酚酸B（500μg/ml）具有抗前列腺肿瘤的作用，其作用从6h左右变得非常明显，台盼蓝拒染实验和MTT结果均显示细胞活力大大减少，P<0.01;流式细胞仪检测到丹酚酸B作用12、24h的BPH1-C5细胞的凋亡率分别高到46.23%和57.87%（图2），在流式细胞图中形成明显的凋亡峰。据此推测，丹酚酸B可能通过诱导前列腺肿瘤细胞的凋亡起到抗肿瘤的作用。参与细胞凋亡的调控蛋白有很多，其中Caspase是一类促进细胞凋亡的重要蛋白。在细胞凋亡过程中，Caspase引起线粒体PT（permeability transition）孔的开放，导致线粒体的跨膜电位下降，同时细胞色素C释放到胞质中，细胞色素C在胞质中可以激活Cas-pase-9，后者再激活Caspase-3。本文为进一步研究丹酚酸B诱导的前列腺肿瘤细胞凋亡的因素，还用Western Blot的方法检测了丹酚酸B作用3、6、12、24h后Caspase-3的表达（资料正在整理中），初步结果显示Caspase-3随着丹酚酸B作用时间的增加其表达量明显增加，与流式细胞仪检测到的凋亡率呈正相关趋势。在丹酚酸B诱导肿瘤细胞凋亡的作用中，Caspase-3的上下游调控蛋白以及与Cas-pase家族作用相反的另一凋亡抑制蛋白家族Bcl-2在其中的作用及其表达如何需进一步研究。
【参考文献】
1 Li M，Zhao C，Wong RN，et al.Inhibition of shear-induced platelet aggregation in rat by tetramethylpyrazine and salvianolic acid B.Clin Hemorheol Microcirc，2004，31（2）:97-103.
2 Zhao JF，Liu CH，Hu YY，et al.Effect of salvianolic acid B on Smad3expression in hepatic stellate cells.Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2004，3（1）:102-105.
3 Tang MK，Zhang JT.Salvianolic acid B inhibits fibril formation and neurotoxicity of amyloid beta-protein in vitro.Acta Pharmacol Sin，2001，22（4）:380-384.
4 Chen YH，Du GH，Zhang JT.Salvianolic acid B protects brain against injuries caused by ischemia-reperfusion in rats.Acta Pharmacol Sin，2000，21（5）:463-466.
5 Tang M，Zhang J.Prostate apoptosis response-4involved in the pro-tective effect of salvianolic acid B against amyloid beta peptide-in-duced damage in PC12cells.Jpn J Pharmacol，2002，88（4）:422-427.
作者单位:256603山东滨州，滨州医学院
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