通心络对糖尿病大鼠肾脏抗氧化能力的影响

　　【摘要】  目的  研究通心络对糖尿病大鼠肾脏的保护作用及作用机制。方法  链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠给予通心络治疗6周后，检测通心络对糖尿病大鼠肾脏氧自由基代谢状态及抗氧化能力的改变。结果  通心络治疗组血糖水平明显高于正常对照组，而与糖尿病大鼠相比，两组血糖水平相当，P＞0.05；与正常对照组大鼠比较，糖尿病大鼠肾皮质丙二醛（MDA）含量增加，通心络治疗组MDA水平高于正常对照组，低于糖尿病组，但差异无显著性（P＞0.05）；与NC组相比，DM组谷胱甘肽(GSH)水平均有下降，差异有显著性（P＜0.05）；与DM组相比，TXL组GSH水平有升高趋势，但仍显著低于NC组水平。与NC组相比，TXL组与DM组超氧化物歧化酶(SOD)水平均降低，差异有显著性。其中TXL组SOD水平高于DM组，但两组间差异无显著性（P＞0.05）。各组大鼠肾脏T-AOC及CAT活性差异均无显著性。结论  通心络可部分改善高糖引起的肾脏氧化应激，提高肾脏的抗氧化能力，对糖尿病引起的大鼠肾脏损害具有一定的保护作用。

　　【关键词】  糖尿病，实验性；通心络；氧化性应激；肾   

　　Effect of Tong xinluo on oxidative stress in the kidney of diabetic rats

　　LIU Yan，ZOU Jun-jie，LI Wen-tong，et al.

　　Department of Endonology，Changzheng Hospital，Shanghai 200003，China

　　【Abstract】  Objective  To study the effects of Tong Xinluo on the oxidative stress and antioxidative system in kidney of diabetic rats.Methods  After the STZ-induced diabetic rats were treated with Tong Xinluo for six weeks，the SOD，CAT，T-AOC，MDA and GSH in kidney cortex were measured.Results  The level of blood glucose in group TXL was higher than that of group CN. And had no significant difference with group DM(P＞0.05). The content of MDA in group DM was higher than group CN(P＜0.05) and lower than group TXL，but showed no significant difference within group DM and group TXL(P＞0.05). The content of GSH increased significantly higher in group TXL than group DM(P＜0.05) but lower than group CN(P＞0.05). The activity of SOD increased significantly in group TXL than in group DM(P＜0.05). Our test showed no significant difference in T-AOC and CAT within all groups.Conclusion  Tong Xinluo could improve the antioxidative ability，decrease oxidative stress and protect the kidney in diabetic rats.

　　【Key words】  diabetes;experimental;tongxinluo;oxidative stress;kidney

　　糖尿病并发症发病的统一机制学说认为，在持续高糖状态下，线粒体活性氧基生成增加可能是导致糖尿病各种并发症发生、发展的中心环节［1，2］，引起糖尿病组织损害的四条通路多元醇通路激活、蛋白质非酶糖化增加、PKC(蛋白激酶C)激活、己糖胺途径激活等实质上都是高糖诱导的超氧化物过表达的结果。由此，氧自由基生成增多引起的氧化应激成为糖尿病微血管病变发生、发展的重要影响因素。有研究证实［3］，通心络可有效降低早期糖尿病肾病的内皮素（ET）水平和尿白蛋白排泄率（UAER），可有效地延缓糖尿病肾病肾功能衰竭的进展。通心络对糖尿病肾脏有一定的保护作用，但机制尚不明确。根据糖尿病并发症的统一发病机制学说，糖尿病肾病的发生、发展及改善与氧化损伤的相应变化密切有关，因此本研究采用通心络治疗糖尿病大鼠，拟从氧化与抗氧化系统方面探讨通心络改善糖尿病肾脏病变的机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料  链脲佐菌素（STZ）购自美国Sigma公司，通心络超微颗粒（成分：人参、水蛭、全蝎、蜈蚣、土鳖虫、赤芍等）由以岭药业提供。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽（GSH）、脂质过氧化物的产物丙二醛（MDA）、总抗氧化力（T-AOC）测定试剂盒购自南京建成公司。血糖测定采用美国罗氏公司血糖测定仪。雄性SD大鼠（体重160～180g），购自上海中科院实验动物中心。

　　1.2  方法

　　1.2.1  DM大鼠模型的制备与处理  大鼠适应性饲养5天，禁食18h后先按体重随机分为2组，一组（15只）大鼠单次腹腔注射STZ 60mg/kg诱发糖尿病，另一组（5只）大鼠同时腹腔注射等体积的上述缓冲液作为对照。注射STZ的动物于注射3天后，空腹血搪持续高于16．7mmol/L，尿糖呈强阳性的动物确定为糖尿病动物。按空腹血糖水平再将糖尿病动物随机分为2组，加上对照组共3组：对照组(5只，control，CN)，糖尿病组(5只，diabetes mellitus，DM)，通心络处理的糖尿病组(5只，diabetes mellitus+Tong Xinluo，TXL)，并开始给药处理。TXL组每天上午灌服通心络水溶液1g/kg，其余2组均灌服等体积稀释液，为维持糖尿病大鼠的存活，根据血糖水平皮下注射诺和灵N2～4U/d，连续处理6周。动物自由进食饮水，每周测量血糖、体重。实验结束前大鼠过夜禁食后乙醚麻醉下摘除眼球取血并处死动物，留取血清。迅速切除双侧肾脏，左肾称重，除留取供形态研究的样品外，切取部分肾皮质，液氮中保存备用。

　　1.2.2  检测指标与方法  血糖水平用罗氏血糖仪测定。制备肾皮质组织匀浆液，用可见光法检测CAT活性；用TBA法测定MDA，用DTNB法定量测定GSH含量；比色法测SOD活性与总抗氧化能力。

　　1.3  统计学方法  实验数据用x±s表示，各组间数据差异显著性均采用方差分析。

　　2  结果

　　2.1  一般情况  造模组注射STZ后24～48h出现多饮、多尿，第3～4天多食明显。通心络处理组及模型对照组大鼠多饮、多尿症状较重，体重不增，毛发无光泽，易脱落。

　　2.2  通心络对糖尿病大鼠血糖及肾脏氧自由基的影响  各模型组与对照组相比，血糖水平明显升高，但各模型组之间血糖水平差异无显著性。各模型组肾体重比与正常对照组相比，差异具有显著性（P＜0.05），各模型组之间差异无显著性。阳性对照组MDA显著升高，与正常对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；与阳性对照组相比，通心络处理组MDA水平有所降低，但差异无统计学意义(P＞0.05)（见表1）。

　　表1  各组大鼠血糖、肾体重比及MDA情况  (略)

　　注：vs NC组，*P＜0.05；MDA：丙二醛；GLU：血糖

　　2.3  通心络对糖尿病大鼠肾脏抗氧化能力的影响  与NC组相比，各模型组GSH水平均有下降，其中TXL处理组GSH水平较DM组有所改善，且差异有显著性（P＜0.05）。与NC组相比，DM组SOD水平降低，差异有显著性，TXL组SOD水平高于DM组但低于NC组，差异均无显著性。NC组大鼠T-AOC及CAT活性高于其他组，但各组间差异均无显著性。见表2。

　　表2  各组大鼠GSH、SOD、T-AOC、CAT水平  (略)

　　注：vs NC组*P＜0.05；vs DM组#P＜0.05；GSH：谷胱甘肽；SOD：超氧化物歧化酶；T-AOC：总抗氧化力；CAT：过氧化氢酶

　　3  讨论

　　糖尿病时机体普遍存在着氧化与抗氧化机制的紊乱，肾组织中活性氧簇（ROS）生成过多、组织中抗氧化酶发生糖化或氧化、还原性物质消耗过多，是造成肾组织氧化损伤的重要机制。氧化损伤进一步导致糖尿病微血管病变如肾小球、视网膜、周围神经，并最终导致1型与2型糖尿病患者失明、肾功能衰竭及发生周围神经病变［2，4］。Lee等［5］已证明在肾小球系膜细胞和小管上皮细胞，高糖是以时间依赖方式诱导对二氯荧光素敏感的ROS的产生。ROS攻击不饱和脂肪酸后，肾皮质中所产生的脂质过氧化产物MDA含量、抗氧化酶（SOD、CAT）活性、T-AOC及GSH改变可反映肾皮质的抗氧化能力和氧化应激程度。可有效逆转高血糖引起的上述因素改变的药物将有利于糖尿病肾病的预防与治疗。

　　3.1  通心络对血糖的影响  现已公认，活性氧对肾组织的损伤作用是肾组织病变的主要发病机制之一，甚至是许多细胞因子损伤肾组织的最终介质，高血糖是诱导超氧化物过表达的主要因素。本研究结果显示，与阳性对照组及褪黑素治疗组相比，通心络在糖尿病诱导成功后给药，未发现有明显的降血糖、升高体重的作用。故分析通心络对糖尿病肾脏的保护作用并不依赖于其调节血糖水平的效应。

　　3.2  通心络对抗氧化能力的影响  糖尿病并发症发病的统一发病机制学说认为，在持续高糖状态下，线粒体活性氧基生成增加可能是糖尿病各种并发症发生的中心环节［1，2］，引起糖尿病组织损害的四条通路多元醇通路激活、蛋白质非酶糖化增加、PKC激活、己糖胺途径激活实质上都是高糖诱导的超氧化物过表达的结果。研究证实高血糖可诱导肾系膜细胞及肾小管上皮细胞内ROS产生的增加［6］，当ROS的损伤作用超过机体的抗氧化作用时，便可通过激活PKC、MAPK及核因子NF-rB［7］而进一步影响血脂、蛋白及DNA的损伤，最终导致慢性并发症的发生。已有一些动物实验和临床研究证实了通心络具有保护超氧化物歧化酶(SOD)活性、清除氧自由基的作用。秦鉴等［8］建立小鼠的缺血再灌注模型，观察高、中、低剂量的通心络对心肌组织SOD活性、丙二醛(MDA)水平，发现通心络能够提高缺血再灌注心肌的SOD活性，降低MDA水平，具有明显的抗氧自由基损伤作用。张子新［9］等的动物实验同样观察到通心络治疗的家兔SOD水平明显升高。杨昆［10］观察通心络胶囊对25例冠心病患者的疗效时发现，通心络治疗组血浆MDA含量降低比对照组明显，而红细胞SOD活性则明显高于对照组。本研究旨在观察通心络对糖尿病大鼠肾脏氧化应激及抗氧化能力的影响。结果显示，与糖尿病大鼠相比，通心络可以显著增加还原性物质GSH的含量，降低肾皮质脂质过氧化产物MDA的含量，增强抗氧化酶SOD、CAT的活性，提高肾脏的T-AOC，从而提高肾脏的抗氧化能力，并减轻高糖引起的氧化损伤。以上结果显示，通心络可以增加机体的抗氧化能力，并在一定程度上清除过氧化物，降低高糖引起的氧化损伤。但其差异不明显，可能与样本量小，实验周期短有关。且具体分子机制尚待进一步研究明确。

　　3.3  通心络在糖尿病并发症治疗中的药用价值  通心络由人参、水蛭、全蝎、蜈蚣、土鳖虫、赤芍等药物组成。现代药理研究表明［11］，人参具有降血脂、血糖的功能，能延缓糖尿病的发生时间，降低尿糖，增高胰岛神经丛特别是内神经丛的胆碱酯酶活性；水蛭有利尿、消除尿蛋白的作用，并能改善微循环；土鳖虫、全蝎具有抗凝、抗血栓形成的作用；赤芍具有降低全血浓度、抑制血小板聚集，降低血小板粘附性，降低纤维蛋白原，抑制血栓形成等作用。全方具有扩张血管、抗凝、降低血浓度、改善微循环的作用。临床研究显示，通心络具有降低早期糖尿病肾病的ET水平，降低肾小球高滤过，改善肾小球基底膜的作用，可有效地延缓糖尿病肾功能衰竭［3］。本实验结果表明，通心络可部分改善高糖引起的氧化损伤，增加机体的抗氧化能力。根据糖尿病并发症的统一发病机制可以认为，通心络对糖尿病微血管病变的发生发展具有一定的防治作用，同时也证明糖尿病微血管并发症属于络病范畴。但其确切作用及作用机制尚需大样本的动物及临床研究进一步证实。

　　【参考文献】

　　1  Ceriello A.New insights on oxidative stress and diabetic complications may lead to a“Causal” antioxidant therapy. Diabetes Care，2003，26(5)：1589-1596.

　　2  Brownlee M. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature，2001 Dec 13;414(6865)：813-820.

　　3  孙世宁，黄红芳.通心络胶囊对早期糖尿病肾病患者血浆、尿内皮素的影响.新中医，2004，36（4）：32-33.

　　4  West IC.Radicals and oxidative stress in diabetes. Diabet Med，2000，17：171-180.

　　5  Ha Ｈ，Yang Y，Lee HB，et al. Mechamisms of reactive oxygen species generation in LLC-PK1 cells cultured under high glucose. J Am Soc Nephrol，2002，13：531.

　　6  Ha H，Yu MR，Choi YJ，et al. Role of high glucose-induced nuclear factor-kappa B activation in monocyte chemoattractant protein-1 expression by mesangial cells. J Am Soc Nephrol，2002，13(4)：894-902.

　　7  Thannickal VJ，Fanburg BL. Reactive oxygen species in cell signaling. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2000，279(6)：1005-1028.

　　8  秦鉴，刘红健，吴国珍，等.通心络胶囊抑制再灌注心肌细胞凋亡的实验研究.中药材，2003，26：801-804．

　　9  张子新，曾定尹，王绽菲.通心络对动脉粥样硬化家兔血管成形术后血管内皮功能的保护作用.中国动脉硬化杂志，2003，11：569.

　　10  杨昆.通心络治疗冠心病疗效观察及其机制初步探讨.海南医学，2003，14：20-21.

　　11  董昆山，王秀琴，董一凡．现代临床中药学．北京：中国中医药出版社，1998，10.
 
　　(编辑：悦  铭)

　　作者单位： 200003 上海，上海市长征医院内分泌科(Δ通讯作者)