穴位埋线对肥胖大鼠瘦素及瘦素受体基因表达的影响

【摘要】  　　目的 探讨穴位埋线方法对肥胖大鼠减肥的作用机制。方法 将SD清洁型断乳1周的雄性大鼠分为五组，分别为正常对照组、肥胖对照组、普通埋线组、药物埋线组和西布曲明组，观察其治疗前后的体重、李氏（Lee’s）指数、体脂变化以及血清、下丘脑中瘦素（Leptin）、胰岛素（INS）的变化、下丘脑瘦素受体（ob-R）基因表达的变化。结果 治疗前肥胖模型组体重和李氏指数显著高于正常对照组，经埋线和药物治疗后，体重与李氏指数显著低于对照组（P<0.01）。治疗前肥胖模型组血清瘦素、胰岛素明显高于正常对照组（P<0.05），经治疗后，治疗各组血清瘦素均显著下降（P<0.05）。与正常大鼠相比，肥胖大鼠下丘脑ob-R基因表达有所下降，但差异无显著性。经埋线和口服药物治疗后ob-R基因表达水平上调。结论 穴位埋线疗法可通过降低肥胖大鼠机体外周血瘦素含量，升高中枢瘦素含量以及上调中枢ob-R基因表达的作用达到干预肥胖的目的。

【关键词】  穴位埋线　肥胖大鼠　瘦素　机制

　　The effects of catgut implantation at acupoint on the leptin and leptin receptor gene expression of obesity Rat

    ZHANG Li-mei, HUANG Xin-yan, YU Mei-xian,et al.Chinese Tradition Medicine University,Hangzhou 310009,China

    【Abstract】  Objective  To investigate  the mechanism of catgut implantation at acupoint on obesity rat.Methods  The depuratory-type and delactation male-rat was divideinto five groups, normal control、obesity control、catgut implantation at acupoint、drug implantation at acupoint and sibutramine.Observation the changes of weight、 Lee′s index、body fat、blood leptin and INS 、hypothalamus leptin-receptor gene expression etc.Results  Before treatment，the weight and Lee’s index of obesity groups significant exceed to normal control group and lower than control group after treatment（P<0.01）.Before treatment，the blood leptin and INS of obesity groups significant exceed to normal control group （P<0.05）and descend significant after treatment（P<0.05）, compared to normal control group , hypothalamus leptin-receptor gene expression of obesity rat minute descend and up-regulation after treatment.Conclusion  Catgut implantation at acupoint can reduce the peripheral blood leptin , advance content of central leptin , up-regulation leptin-receptor gene expression then achieve the aim to obesity intervention.

    【Key words】  catgut implantation at acupoint; obesity rat; leptin; mechanism

    肥胖病（obesity）是当代威胁人类健康的常见病及多发病，也是世界卫生组织确定的疑难疾病之一。肥胖病可引起各种心脑血管疾病、代谢紊乱、免疫功能下降［1］等，严重影响了患者正常的生活与工作。目前已有多篇关于穴位埋线治疗肥胖病有效的临床报道，我们近五年的临床实践也证实了此法的疗效，但尚未有阐明其机制的研究报道。本实验以肥胖大鼠为研究对象，以祖国医学针灸经络学为理论指导，将医用羊肠线植入肥胖大鼠模型特定的穴位，观察五组（正常对照组、普通埋线组、药物埋线组、西布曲明组、肥胖对照组）大鼠在治疗前后体重、李氏（lee’s）指数［3   体重（g）/体长（cm）×103］、体脂的变化以及血清、下丘脑中瘦素（Leptin）、胰岛素（INS）的变化,下丘脑瘦素受体（ob-R）基因表达的变化。以探讨穴位埋线对肥胖大鼠瘦素及瘦素受体基因表达的影响，并阐明穴位埋线治疗肥胖病可能的机制。

　　1  实验材料和方法

    1.1  大鼠  断乳1周SD雄性大鼠，体重在70～90g，由中国科学院上海实验动物中心提供。参照刘氏提供的实验性大鼠肥胖造摸方法，稍加改进［2］。

    1.2  实验步骤

    1.2.1  动物分组  以普通全价鼠饲料喂养的大鼠作为正常对照组（10只），将造模成功的实验性肥胖大鼠随机分为4组，一组不做任何治疗为肥胖对照组（10只），余下为普通埋线组（10只）、药物埋线组（10只）、西布曲明组（10只）。

    1.2.2  治疗方法  各组大鼠实验期间均采用普通全价鼠饲料喂养，自由摄食和饮水，每日更换饲料和水。穴位埋线组（普通埋线组、药物埋线组）大鼠每10天埋线1次，从穴位：中脘、气海、天枢（双）、足三里（双）、曲池（双）、脾俞（双）中选穴［3］，每次选2对，共治疗3次。西布曲明组根据说明将药片碾成粉末状，超声乳化成4％溶液每日喂1次，每次1.1ml。正常对照组及肥胖对照组不做任何治疗。

    1.2.3  实验方法  造模成功后，将造模成功的实验肥胖大鼠随机分为肥胖对照组（10只）、普通埋线组（10只）、药物埋线组（10只）、西布曲明组（10只）。观察治疗前后大鼠的摄食量、饮水量、大小便的变化，测量体长、体重、李氏（Lee’s）指数［3   体重（g）/体长（cm）×103］及其血清瘦素（Leptin）、胰岛素（INS）。实验结束后，禁食过夜，次日断头处死，采集全血，静置分离血清，-20℃保存待测。迅速分离心包、肾周脂肪，称重并记录，同时冰块上迅速分离下丘脑，-70℃保存待测。

    1.2.4  检测方法

    1.2.4.1  放射免疫法  采用放射免疫法检测血清瘦素和胰岛素，试剂盒由北京科美东雅生物技术有限公司提供，用SN695智能γ测量仪（上海原子核研究所日环仪器厂）测定。

    1.2.4.2  RT-PCR检测  （1）总RNA提取：取-70℃冻存大鼠下丘脑以1：10比例加入Trizol核酸提取液，在冰浴下超声波制成匀浆。按照上海申能博彩生物科技公司Trizol提取试剂盒说明书的操作步骤提取下丘脑总RNA，用DNA/RNA纯度测定仪进行定量。（2）逆转录：2μg的总RNA逆转录合成cDNA。逆转录反应按照上海申能博彩生物科技公司试剂盒说明书进行。取2μg的总RNA，加DEPC水至8μl，再加入0.5μl的Ribonuclease inhibitor和2μl的oligo（dt）18 primers，小心混匀后65℃恒温箱中保温5min，再-20℃保存10min后，按顺序加入下列试剂:5Xfirst-stand Buffer 4μl，Ribonuclease inhibitor 0.5μl，100mM DTT 2μl，dNTP mix 2μl，MMLV Reverse Transcriptase 1μl。离心5s后，37℃保温1h，90℃保温5min，室温冷却后取RT产物加入180μl RNase Free dH2O，高速离心5s，20μl分装为10份，-20℃保存。（3）引物设计与合成：根据ob-RcDNA序列，设计合成了扩增的ob-RcDNA的引物。由上海申友生物技术有限公司合成，引物序列为：ob-R上游引物：5′-TGAGATGGTCCCAGCAGC-TATG-3′（2872-2893），ob-R下游引物：5′-CCAAAAGCTCATC-CAACCCCGA-3′（3260-3239），产物：389bp。内参β-actin上游引物：5′-TTCCAGCCTTCCTTCCTGG-3′，下游引物：5′-TTGCGCTCAGCAGGAGCAAT-3′，产物：225bp。（4）PCR扩增反应：按照上海申能博彩生物科技公司试剂盒说明书进行。反应体系：RT产物 2μl，10×PCR Buffer 2.5μl，MgCl2 1.8μl，10mM 4×dNTP 0.5μl，β-actin上游引物 0.5μl，β-actin下游引物 0.5μl，Taq酶0.5μl，RNase Free dH20加至25μl混匀，短暂离心。PCR条件：94℃ 2min→94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1.5min，35个循环→72℃ 7min。（5）产物分析：取PCR产物20μl，加上样缓冲液4μl，混匀后加入加样孔，置电泳槽中，加入1×TAE缓冲液，90V电泳30min后，取出电凝胶，置紫外灯下观察，进行照相并用图像分析系统进行半定量分析。

　　2  实验结果与分析

    2.1  实验各组大鼠体重、体长和Lee’s指数的比较  见表1。表1  实验各组大鼠体重、体长和Lee’s指数的比较 注：组间比较，*P<0.05,**P<0.01

    由表1可知，与对照组相比，在体长变化无显著差异的基础上，埋线组和西布曲明组均可有效控制大鼠体重的过度增加，P<0.05，其中药物埋线和西布曲明还可明显控制Lee’s指数的增加，P<0.01，但两者之间差异无显著性。

    2.2  实验各组大鼠肾周脂肪、心包脂肪的比较  见表2。表2  实验各组大鼠肾周脂肪、 心包脂肪的比较注：组间比较，*P<0.05

    肥胖对照组肾周脂肪、心包脂肪显著高于正常对照组P<0.05，各治疗组2部位脂肪量显著低于肥胖对照组，与正常对照组差异无显著性。

    2.3  实验各组大鼠血清瘦素、胰岛素水平的比较  见表3。表3  实验各组大鼠血清瘦素、 胰岛素水平的比较  注：组间比较，*P<0.05,**P<0.01;本组治疗前后比较，#P<0.05

    治疗前,肥胖各组血清瘦素、胰岛素均明显高于正常对照组，P<0.05，说明肥胖大鼠存在瘦素抵抗和胰岛素抵抗。经治疗后，治疗各组血清瘦素均显著下降，P<0.05，与肥胖对照组比较，西布曲明组、药物埋线组血清瘦素下降明显，P<0.01，与正常组差异无显著性；普通埋线组较肥胖对照组显著下降,但仍高于正常对照组，P<0.05，说明埋线疗法可以有效改善瘦素信号的传导，但尚未显示出对血清胰岛素的影响，提示埋线疗法对于瘦素抵抗的干预可能先于胰岛素抵抗。

    2.4  穴位埋线对肥胖大鼠下丘脑ob-R mRNA表达的影响  见图1。

    2.5  实验各组大鼠下丘脑Ob-R基因表达水平的比较   见表4，图2。表4  实验各组大鼠下丘脑Ob-R基因表达水平的比较注：组间比较*P<0.05

    结合表4和图2，可以看出肥胖各组的下丘脑ob-R基因表达水平与正常组比较，有所下降，但差异无显著性，经埋线和口服药物治疗后ob-R基因表达水平上调，埋线组大于口服药物组P<0.05，但仍低于正常组，其中普通埋线组与药物埋线组之间差异无显著性。3  讨论

    肥胖病是人体体重超常的疾病，其发病机制与遗传、中枢神经系统异常、内分泌功能紊乱、代谢因素和营养不平衡等有关［4］。1994年Zhang等成功克隆并鉴定了人类肥胖基因和它所表达的蛋白产物-瘦素（Leptin）［5］,认为瘦素为肥胖基因的编码产物，它是由脂肪细胞分泌的一种循环激素，可通过多种途径发挥作用。瘦素的中枢作用主要通过下丘脑-神经肽通路与中枢神经系统中瘦素受体（ob-R）结合，进一步发挥生物学效应。当人体体重增加时，外周循环中瘦素水平增高，通过与下丘脑中瘦素受体结合，减少下丘脑神经肽（NPY）合成分泌，出现摄食减少、能耗增加、交感神经功能加强等一系列反应，使体重下降。瘦素在神经内分泌调节中起着重要作用，且其浓度与胰岛素的分泌相互影响［6］。近年来大量研究表明，人类肥胖患者大多存在有瘦素抵抗现象，即虽然体内有较高的瘦素水平，但由于其信号传导过程存在缺陷，导致其无法发挥生物学效应，瘦素抵抗的存在还破坏了正常的“脂肪－胰岛素轴”的反馈机制，影响人体的物质代谢，导致高胰岛素血症、高脂血症及冠心病等疾病的发生。因此在肥胖症的治疗中干预瘦素抵抗，改善瘦素信号传导的方法就成为治疗肥胖的突破口。

    穴位埋线疗法是一种新兴的经络穴位刺激疗法，它是在中医脏腑、气血、经络理论指导下，利用一次性埋线针，将医用羊肠线或经中药药物浸泡制作过的药物羊肠线植入相应的俞穴和特定的部位，当羊肠线在局部逐渐软化、分解、液化和吸收的过程中对穴位产生持续的物理及生物化学刺激作用，起到调节神经内分泌作用，达到治疗疾病的目的［7］。

    体重和李氏指数的变化是干预肥胖症瘦素抵抗最直接的表现，其中李氏指数是影响血清瘦素水平的主要因素［1］。本实验研究发现肥胖大鼠大都存在着瘦素及胰岛素抵抗现象，经穴位埋线与西布曲明治疗后可有效地减少外周血的瘦素水平，增加中枢的瘦素含量并上调ob-R基因表达，从而改善血清瘦素信号的传导，干预瘦素抵抗。但本研究尚未发现对血清胰岛素的影响，提示埋线疗法对于瘦素抵抗的干预可能先于胰岛素的抵抗。

    以内脏脂肪为主的腹型肥胖是瘦素抵抗的主要临床特征，体脂的分布异常是诱发糖尿病、心脑血管等肥胖并发症的重要危险因素［8］。本实验通过对治疗前后的肾周、心包脂肪变化发现：埋线疗法可以有效减少内脏脂肪量,说明埋线疗法可以有效干预瘦素抵抗诱导的一系列恶性循环。

    综上所述，穴位埋线疗法可以有效地畅通瘦素的信号传导，从而干预肥胖及其并发症的发生，但由于穴位埋线的机理较为复杂，关于其对于肥胖发生的具体作用机制仍有待于进一步研究，以期为临床提供更大的指导意义。

【参考文献】
  　　1 李春生.现代肥胖病.北京:科学技术文献出版社,2004,19-21，64.

2 刘志诚.针刺对肥胖大鼠瘦素水平和瘦素瘦体基因表达的作用.中国针灸,2003,7（23）：412-416.

3 于船.中国兽医针灸学.北京:农业出版社,1994,286-290.

4 傅祖植.开展与肥胖病相关课题的研究是新世纪的迫切任务.中华内分泌代谢杂志,2000,16（2）:65-66.

5 ZhangYY，Prsenea R，Moffei M，et al.Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue.Nature,1994,372:425.

6 Halaas JL，Gajiwala KS，Maflei M,et al.Weight-reducing effects of the plasma protein encoded by the obsess gene.Science,1995,269:543.

7 陈德林.实用穴位埋线疗法.天津:天津社会科学出版社，1993，3.

8 张建，华琦.代谢综合征.北京:人民卫生出版社，2003，144-145.

（编辑：守 中）

作者单位：基金项目：浙江省教委科研基金资助项目（NO.20040643）　1 310009 浙江杭州，浙江中医药大学　 2 浙江杭州，浙江大学医学院3 浙江金华，金华市人民医院　4 北京，北京任晓艳穴位埋线医学研究中心