糖尿病心肌病动物模型研究进展

【摘要】  　　综述近几年糖尿病心肌病实验动物制备方法的研究概况。糖尿病（diabetesmellitus，DM）是当今严重危害人类生命健康的重大疾病。研究证实，糖尿病患者罹患心血管疾病的比例远远高于非糖尿病患者。1972年Rubier首次提出糖尿病心肌病（diabetic cardiom yopathy）的概念，用以描述糖尿病患者在冠脉搭桥术后仍可发生充血性心力衰竭的疾病状态［1］。后经尸检等多方面证实，糖尿病患者确实存在特异性糖尿病心肌病的病理状态，对糖尿病患者的生存质量及预后有很大影响。但目前对该病的发病机制及诊治措施的研究还很不完善，而临床对该病病例的确诊及相关组织研究（尤其是心肌组织的获取）困难较大。故如何科学简便地制备糖尿病心肌病动物模型就显得越发重要。已知制备糖尿病动物模型的方法主要有自发性和诱发性两大类。诱发性糖尿病动物模型的制备方法主要有外科手术法、化学物质诱导法、转基因糖尿病动物法。所涉及的动物种类有大鼠、小鼠、猫、犬、小猪等。许多模型的制备方法复杂，可重复性有限，费用高，不宜推广［2］。目前尚缺乏针对糖尿病心肌病这一特异性心肌病动物模型制备方法的系统研究和论证。本章就糖尿病心肌病动物模型研究进展进行综述：首先简单介绍一下近期文献上报道的糖尿病动物模型。

【关键词】  糖尿病　动物　心肌病

　　实验性糖尿病动物模型（experimental diabetic animal model）是指通过物理、生物、化学等致病因素人工诱发出的具有糖尿病特征的动物模型。具有耗时短，方法简便，易于掌握，重复性好的特点，短期内可诱导出大量模型［3］。

　　1  药物方法

    1.1  链脲佐菌素法［4］

    1.1.1  动物  选取Sprague2Dawley大鼠96只，均由西安交通大学医学院动物实验中心提供，雌雄各半，分笼饲养。均用普通大鼠饲料喂养。饮用自来水。

    1.1.2  药物  链脲佐菌素干粉购自美国Sigma公司（批号：Ｓ20130）精蛋白锌胰岛素注射液购自上海生物化学制药厂（批号：沪卫1995第0010208），四氧嘧啶干粉购自广州科星化学制品厂（批号：粤卫准字1998第011352）。

    1.1.3  模型制备  随机将大鼠分为正常组（normal）12只，对照组（control）12只，实验组56只。正常饲养1周后，禁食24h，期间自由饮水“将链脲佐菌素（STZ）用0.1mmol/L,pH4.2柠檬酸缓冲液新鲜配制待用”实验组大鼠用上述溶液以55mg/kg一次性左下腹腔注射，动作力量适中，避免伤及内脏及血管［5］“对照组等体积缓冲液”再给以5%葡萄糖溶液进水，普通饲料喂食“48h后换以自来水饮用［6］。72h后检测尿糖、血糖情况。以空腹血糖>11.1mmoI/L,非空腹血糖>16.7mmol/L纳入糖尿病组，稳定1周后，将一部分糖尿病大鼠从第3周起（即注射STZ 1周后），给以长效精蛋白锌胰岛素注射液预防性治疗［7］（预防组INSpro,n=18），平均2～4Upd,一部分糖尿病大鼠从第5周起（即注射STZ 3周后）给以长效精蛋白锌胰岛素注射液治疗［8］（治疗组INSrem,n=18）,其他糖尿病大鼠正常喂养（模型组model,n=20）”另用16只大鼠行四氧嘧啶腹腔注射［9］（250mgPkg,n=8）和舌下静脉注射（65mgPkg,n=8）对照实验。

    1.1.4  观察指标  观察动物一般状况，死亡比例，进食量，尿量的变化，每周称量体重1次。检测尿糖、血糖情况。血糖采用强生公司One Touch Profile血糖仪测定“每半月在麻醉状态下检测心电图［10］，并分别于第3、4、5、9、13周处理部分动物，取其心肌组织行电镜检测”用光镜观察其心脏大血管内膜变化。将其血清行肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、胰岛素（insulin）检测［11］。

    1.2  联合STZ和ALX制备大鼠糖尿病模型

    1.2.1  模型的建立［12］  选取8周龄的Wistar雄性大鼠30 只,体重约180～220g,由哈尔滨医科大学动物实验中心提供,实验期间大鼠饲养于该实验中心"随机选取15只大鼠,禁食12h后,应用STZ（美国sigma公司产品），使用前临时以0.1mmol/L（pH4.5）柠檬酸钠缓冲液按30mg/kg配制成12mg/ml的浓度；ALX（美国公司产品）使用前临时以蒸馏水按50mg/kg配制成20mg/ml的浓度；用5ml注射器分别抽取两种药物，于大鼠左下腹部按正常速度一次性注射STZ和ALX各0.5ml，其余15只以同样方法注射等量生理盐水，空腹1h后，饲以蛋白质含量为21%的标准饲料块，自由饮水分别于给药后3天、1周，分次断鼠尾采血测定血糖值（选用美国强生牌血糖仪及试纸）选择给药后1周后血糖值16.5mmol/L,明显出现多饮、多食、多尿等症状的12只大鼠定为糖尿病动物模型组（血糖没达到以上标准的动物未入选），其余15只作为空白对照组两组动物正常饮食水，继续饲养12周。

    1.2.2  血糖、血脂的测定  分别于成模后6周、12周分次断尾采血测定血糖值。于12周末病理取材过程中，以5ml无菌注射器抽取主动脉血2ml测定血胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL2ch）和极低密度脂蛋白胆固醇（VLDL2ch）含量，应用Beckman公司的L×20全自动生化分析仪进行测定［8］。

    1.2.3  病理学检查  继续饲养12周后，用电子秤称量动物体重，将实验动物以3%戊巴比妥钠麻醉，打开胸腔，暴露并取出心脏，置于生理盐水中反复冲洗，洗净残留积血，用滤纸吸干，以分析天平称量心脏重量，以计算心脏/体重比值；选取心室横径最宽处以无菌组织剪刀剪取左心室心肌组织0.5cm×0.5cm，置于4%多聚甲醛中固定，之后系列乙醇脱水，常规石蜡包埋，均匀间断切片5～10张，切片厚度约4～5μm，做HE染色同时剪取0.1cm×0.1cm大小左心室心肌组织置于2.5%戊二醛中固定，常规处理，超薄切片厚度约50～80nm，选用日本电子公司生产的JEM21220型透射电镜作电子显微镜观察摄片［9］。

    1.2.4  一般状况  药物模型组大鼠每天的进食量、饮水量及排尿量均为空白对照组的2倍以上，明显消瘦，毛发无光泽脱落，活动减少，个别大鼠出现白内障；空白对照则无明显异常。

    1.2.5  血糖、血脂的改变  模型组大鼠给药后3天血糖值明显升高（19.65±3.24）mmol/L，给药后1周血糖值达最高（25.61±2.45）mmol/L，之后稍有回落，但均超过16.5mmol/L的标准值；与对照组血糖值均在正常范围内，P<0.05,差异有显著性。模型组大鼠血脂中C、LDL值与对照组无明显差异，但TG值为（1.61±0.13）mmol/L，VLDL值为（32±0.03）mmol/L，明显高于对照组的（1.21±0.24）mmol/L,（0.24±0.03）mmol/L，P<0.05，差异有显著性。测定结果提示，模型组大鼠已出现明显血糖血脂代谢异常。

    2  药物加手术方法［13］

    李景荣［14］等将模型组大鼠行右侧肾切除术，2周后腹腔单剂量注射STZ35mg/kg，注射72h后尾静脉采血，用血糖仪测定全血血糖≥16.7mmol/L，同时检测尿糖（++～+++），达到上述水平确定为糖尿病大鼠。倪连松等在氯胺酮付清注射麻醉下接受右侧肾切除术，然后采用腹腔一次性注射STZ（Calbiochm公司，45mg/kg）24h后用One touch Ⅱ血糖仪（强生公司产品）测定尾静脉全血血糖，但血糖≥13.8mmol/L时作为糖尿病大鼠。魏军平等将模型大鼠适应性喂养1周后，用10%的水合氯醛0.35ml/100g腹腔注射麻醉大鼠，从距左脊肋骨1.5cm处斜向外方切口，暴露肾脏病肾脏脂肪囊，行左肾切除术后2周，将切除的肾脏的大鼠按体重，经腹腔内注射45mg/kg（STZ溶pH4.0酸缓冲溶液中）。48h后经大鼠眶后静脉丛取血测血糖，凡血糖水平高于16.7mmol/L且尿糖呈强阳性作为糖尿病模型［15］。3  db/db小鼠

    db/db小鼠是Leptin受体基因缺陷导致的先天肥胖性2型糖尿病小鼠，具有高血糖、高血脂、胰岛素抵抗等特性。Db/db小鼠出生1个月后逐渐出现肥胖、高血糖、高血脂、糖尿等糖尿病症状［16］。其发病过程与人T2DM非常相似，是国际上广为采用的研究T2DM和DN的动物模型［17］。目前国内用于试验的这种鼠一般从美国动物中心引进。4  存在问题和展望

    以实验动物复制人类疾病是促进医学科学发展的重要途径，对疾病的病因或发病机制探讨以及预防与治疗方法的改进，均有重要作用。

【参考文献】
  1 李如意，王建华.糖尿病性心肌病的研究进展.临床荟萃,2002,17:4.

2 杜冠华 ,李学军 ,张永祥,等.药理学实验指南新药发现和药理学评价.北京：科学出版社，2001,698-772.

3 李聪然，游雪甫，蒋建东.糖尿病动物模型及研究进展.中国比较医学杂志,2005,15:1.

4 张均田.现代药理学实验方法.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998,981-988.

5 Saini KS,Thompson C,Winterford CM,et al.Streptozotocin at lotuses induces apoptosis and at high doses causes necrosis in armoring pancreatic beta cell line INS21.1BiochemMolBiollnt，1996，3（6）：1229-1236.

6 Likuta,Rossini AA.Streptozotocin induced pancreatic insulates new model of diabetes mellitus.Science,1976,193:415-417.

7 Rossini AA,Williams RM,Appel MC,et al.Sex difference in the multiple dose streptozotocin model of diabetes.Endocrinology,1978,103:1518-1520.

8 Anastasi E,Dotta F,Tiberti C,et al.Insulin prophylaxis down-regulates islet antigeu expression and islet autoimmunity in the low-dose Stz mouse model of diabetes.Autoimmunity,1999,29:249-256.

9 施新猷.现代医学实验动物学.北京：人民军医出版社，2000,482-484.

10 王军，陈国华.大鼠脑缺血模型研究进展.中医研究,2002,15:5.

11 任骏,罗雪琚.糖尿病心肌病的基础与临床研究现状.心血管病学进展,2001,22:5.

12 金钟一,赵进军,毕亚艳,等.联合STZ和ALX制备大鼠糖尿病模型的心肌病理学观察.黑龙江：哈尔滨医科大学学报,2005,39:1.

13 汪谦.现代医学实验方法.北京：人民卫生出版社,1997,926-931.

14 李景荣,熊术道,汪延辉,等.泛影葡胺对糖尿病肾病大鼠心肌细胞内皮素受体A表达的影响.中国临床药理学与治疗学,2004,9（2）:226-229.

15 张芳林,李果,刘优萍,等.2型糖尿病大鼠模型的建立及其糖代谢特征分析.中国实验动物学报,2002,10（1）:16-201.

16 朱加明,刘志红,黄燕飞,等.大黄酸对db/db小鼠糖尿病肾病疗效的观察.肾脏病与透析肾移植杂志，2002，11（1）：3.

17 Colerman DL.Diabetes-obesity syndromea in mice.Diabetes,1982,31:1.

（编辑：李 木）

作者单位：1 130500 吉林九台，九台市中医院中医内科 2 吉林九台，九台市第一人民医院中医科