灯盏花颗粒主要药效学试验

    【摘要】 目的  应用二道血流速度流量仪超声探头测定大鼠颈总动脉（结扎颈外动脉）以反映云南植物药业有限公司提供的灯盏花颗粒对脑血流量的影响;记录小鼠断头后张口喘气时间，观察灯盏花颗粒的抗脑缺血作用。 方法  采用Born方法测定灯盏花颗粒在体内外对AA、ADP及PAF诱导的家兔血小板聚集功能的影响;运用电刺激大鼠颈动脉血栓形成方法，评价灯盏花颗粒对血栓形成的阻抑作用。 结果  灯盏花颗粒显著增加脑血流量并延长小鼠断头后喘气时间;灯盏花颗粒在体内外均明显抑制AA、ADP及PAF诱导的血小板聚集功能的同时还显著延长电刺激大鼠颈动脉的血栓形成时间。 结论  灯盏花颗粒可能通过抗血小板和抗血栓形成等机制来明显增加脑组织的血供，这对保护缺血性脑组织是十分有利的。

    Pharmacokinetic experiment of Erigeron breviscapus pellets

    Li Jun，Yang Yingning

    Physiological Department，Kunming Medical College，Kunming650031.
   
    【Abstract】 Objective The arteria carotis externa was ligated，and arteria carotis interna was kept opening The left carotid artery was exposed and placed over an ultrasonic flow probe.The brain flow volume was recorded with an ultrasonic volume meter.The pursiness time of mice was observed to evaluate the effect of Erigeron breviscapus pellets on cerebral ischemia.Methods Born's method was used to investigate effects of Erigeron breviscapus pellets on rabbit platelet aggregation induced by adenosine diphosphate（ADP），arachidonic acid（AA），and platelet-acti-vating factor（PAF），in vitro or in vivo.Antithrombotic effects of Erigeron breviscapus pellets was monitored accord-ing to Peter's method.Results The results showed that Erigeron breviscapus pellets significantly increased brain blood flow and prolonged mouse pursiness time;Erigeron breviscapus pellets markedly inhibited ADP-，AA-，or PAF-induced platelet aggregation in vitro or in vivo，and prolonged the occlusion time of electrically-stimulated carotid artery.Conclusion It is suggested that Erigeron breviscapus pellets improved cerebral ischemia and hypoxia due to its antiplatelet and antithrombotic effects.It is obviously advantageous to protect ischemic brain tissue.

    【Key words】 erigeron breviscapus pellets platelet aggregation thrombosis brain blood flow

    血小板聚集性增高在血栓栓塞性疾病的发生发展过程中起着重要作用 ［1］ 。灯盏花［Erigeron breviscapus（Vant.）Hand.-Mazz］是云南省特有的民族药用植物，民间主要用其防治中风偏瘫等疾病。灯盏花颗粒的主要有效组分是灯盏花总黄酮（Erigeron reviscapus flavones），主要成份有灯盏花素、芹菜素、4′-羟基黄芩素等 ［2］ 。灯盏花颗粒临床主要用于防治缺血性（或血栓栓塞性）脑血管疾病。多年临床实践证明，灯盏花颗粒对脑缺血、脑血栓病等血淤性疾病疗效甚好。为进一步保护该产品，本试验着重研究灯盏花颗粒对大鼠脑血流量、小鼠断头喘气时间的影响，同时测定灯盏花颗粒的抗血小板及抗血栓形成作用，以期为进一步保护和利用该产品提供药效学试验依据。

    1 材料

    1.1 动物 ICR小鼠及雄性SD大鼠，由云南省天然药物药理重点实验室动物室提供（滇实动证字第9806、9805号）;健康家兔，体重2～2.5kg，雌雄均用，均由昆明医学院动物科提供（滇实动证字第2002082号）。

    1.2 药物及试剂 灯盏花颗粒，规格:5g/包（0.6g浸膏/包）;试验用药料浸膏，1g浸膏等于4g生药，批号:20010704，由云南植物药业有限公司提供。复方丹参滴丸，规格:0.25g/粒，批准文号:（95）卫药准字Z-01号，批号:20010117，由天津天士力制药股份有限公司生产。花生四烯酸（arachidonic acid，AA）和血小板活化因子（platelet acti-vator factor，PAF）均购自美国Sigma公司，临用前分别用100mmol/L的Na 2 CO 3 溶液及含0.25%小牛血清蛋白的Tris-NaCl缓冲液稀释。腺苷二磷酸（adenosine diphosphate，ADP）系Fluka公司产品，以磷酸盐缓冲液溶解备用。

    1.3 仪器 SEN-7203型电刺激仪，日本Nihon Kohden公司产品;DVM-4200型二道血流速度流量仪，日本Hayashi Denki公司生产;LBY-NJ2型血液凝聚仪，由北京普利生精密仪器研究中心生产。

    2 方法与结果

    2.1 对大鼠脑血流量的影响 ［3］  雄性SD大鼠，体重180～220g，随机分为5组，每组8只，即等体积生理盐水组、187.5、375、750mg/kg的灯盏花颗粒组和375mg/kg的复方丹参滴丸组。大鼠以30mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，分离颈总动脉并结扎颈外动脉;打开腹腔，找出十二指肠。用二道血流速度流量仪超声探头于近头端测定正常的颈总动脉血流量（此时，颈总动脉的血流量主要反应脑血流量），待平稳后，经十二指肠分别给予上述药物，30min后，同上测量颈总动脉血流量，观察药物对大鼠脑血流量的影响。结果表明，高、中剂量的灯盏花颗粒及375mg/kg的复方丹参滴丸均明显增加大鼠脑血流量，见表1。

    2.2 对小鼠断头后张口喘气时间的影响 ［3］  体重18～22g的ICR小鼠，雌雄各半，随机分成5组，每组10只，即等体积的生理盐水组、187.5、375、750mg/kg的灯盏花颗粒组和375mg/kg复方丹参滴丸组。实验组按0.2ml/10g灌胃给药，每日1次，连续5天。于末次给药后1h，将小鼠逐只断头，立即按秒表记录小鼠断头后张口喘气停止时间作为抗脑缺血指标，数据以t检验行组间统计学处理。结果显示，高、中剂量的灯盏花颗粒及复方丹参滴丸均明显延长正常小鼠断头张口喘气时间，见表2。

    表1 灯盏花颗粒对大鼠脑血流量的影响 （略）注:n=8，与生理盐水组或给药前比较 * P<0.05， ** P<0.01

    表2 灯盏花颗粒对小鼠断头张口喘气时间的影响 （略）注:n=10，与生理盐水组比较 * P<0.05， ** P<0.01

    2.3 对家兔血小板聚集功能的影响

    2.3.1 富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）和贫血小板血浆（platelet-poor plasma，PPP）的制备自清醒家兔颈动脉取血收集于塑料离心管中，以3.8%枸橼酸钠抗凝（血与 抗凝剂体积比9:1）。于室温下1000r/min离心10min，得PRP，吸出PRP于洁净塑料管中;剩余血液再以3000r/min离心10min得PPP。PPP用于调零或调整PRP中的血小板数目，试验过程中血小板数控制在5×10 11 cell/L。

    2.3.2 血小板聚集性测定 体外试验:将供试品用生理盐水溶解并稀释成不同浓度的药液备用，分别取10μl药液或生理盐水于PRP中，37℃温育10min。按Born氏比浊法 ［4］ ，即PPP调零及PRP调幅后，分别加入5μl的AA（终浓度0.35mmol/L），ADP（3μmol/L）或PAF（7.2nmol/L），在血小板聚集仪上测定血小板聚集性并记录5min内血小板最大聚集率，血小板聚集抑制率按下式计算:血小板聚集抑制率（%）=［1-（给药管聚集百分率/对照管聚集百分率）］×100用直线回归法求出药物的半数抑制浓度（50%inhibito-ry concentration，IC 50 ）结果表明，灯盏花颗粒显著抑制AA、ADP或PAF诱导的血小板聚集，并呈浓度依赖关系，其IC 50 分别为1.81，3.97和4.93g/L;复方丹参滴丸对ADP及PAF诱导的血小板聚集均呈浓度依赖性明显抑制作用，其IC 50 分别为0.96和4.2g/L，对AA诱导的血小板聚集抑制作用稍弱，求不出IC 50 ，见表3。体内试验:家兔随机分成5组，每组5只，即等体积生理盐水组、187.5、375、750mg/kg的灯盏花颗粒组和375mg/kg的复方丹参滴丸组。上述各组份均以5ml体重灌胃。给药前取血一次，给药后0.5、1、2、3和4h分别取血，同体外试验方法制备PRP和PPP，观察药物灌胃后对AA、ADP和PAF诱导的血小板聚集功能的影响。体内实验结果表明，灯盏花颗粒灌胃后均具有明显抑制血小板聚集作用。表现为，对AA诱导的聚集:187.5mg/kg时无明显抑制血小板聚集，375和750mg/kg剂量灌胃后1h起效，于3h达最大效应，药效至少可持续4h;复方丹参滴丸于给药后2h起效，药效可持续4h;对ADP诱导的血小板聚集:187.5mg/kg的灯盏花颗粒于给药后2h起效，可持续4h，当剂量增大至375和750mg/kg时，于灌胃后1h起效，且随时间的延长，血小板聚集率不断下降;对PAF诱导的血小板聚集:三种剂量的灯盏花颗粒均于给药后1h产生抑制血小板聚集作用，3、4h达最大抑制作用，而375mg/kg的复方丹参滴丸只是于给药后3h会有一过性的降低血小板聚集率作用，见表4。

    表3 灯盏花颗粒对AA、ADP和PAF诱导的兔血小板聚集的影响 （略）注:n=5，与生理盐水组比较 * P<0.05， ** P<0.01
   
    表4 灯盏花颗粒灌胃对AA、ADP和PAF诱导血小板聚集功能的影响 （略）注:n=5，与给药前（0h）比较 * P<0.05， ** P<0.01

    2.3.3 对电刺激大鼠颈动脉血栓形成的影响 ［5］  雄性SD大鼠，250～300g，随机分5组，每组6只，即等体积生理盐水组、187.5、375、750mg/kg的灯盏花颗粒组和375mg/kg的复方丹参滴丸组。各组动物均以1ml/100g体重一次性灌胃，给药45min后用戊巴比妥钠以30mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，然后分离左颈总动脉，测定正常的血流量，然后放置两根银制电极于血管两端，通以直流电刺激，并调电流1.5mA，连续刺激n，同时于近头端测量血流量。从刺激开始至血流量为零的时间为血栓形成时间（occlusion time，OT）。结果表明，高、中剂量的灯盏花颗粒及复方丹参滴丸均明显延长电刺激大鼠颈动脉的血栓形成时间，见表5。

    表5 灯盏花颗粒对电刺激大鼠颈动脉血栓形成的影响 （略）注:n=6，与生理盐水组比较 * P<0.05， ** P<0.01

    3 讨论

    针对云南植物药业有限公司研制的灯盏花颗粒的主要临床运用，本试验进行了相关药效学实验，结果表明:血小板在不同诱导剂的作用下发生不同的活化反应。根据活化反应的强弱，可将诱导剂区分为弱诱导剂如ADP，强诱导剂如PAF，AA则介于其中间 ［6］ 。本实验结果表明灯盏花颗粒在体内外均明显抑制ADP、AA和PAF引起的血小板聚集，并与浓度（剂量）呈正相关性，提示灯盏花颗粒表现为非选择性的抑制血小板活化反应。目前公认，血小板活化有ADP、AA和PAF三条途径 ［7］ ，但最终通过降低血小板内cAMP水平并增加细胞内游离钙离子浓度而引起血小板活化聚集 ［8］ 。灯盏花颗粒对这三条途径均有抑制作用，因此不可能作用于某一诱导剂的特异受体，而以通过某一共同环节抑制血小板活化最为可能。大多数黄酮类化合物（包括灯盏甲素和乙素）抑制cAMP-磷酸二酯酶（PDE），而升高cAMP含量 ［9］ ，我们推测灯盏花颗粒的作用可能是由于抑制PDE，升高血小板内cAMP，使细胞内Ca 2+ 降低，从而产生抑制血小板聚集作用。电刺激大鼠颈动脉所形成的血栓与人体动脉血栓相似。采用血流量仪替代点式温度计来判断OT，则排除了室温的影响，其结果更精确可靠。灯盏花颗粒明显延长动脉OT，表明灯盏花颗粒具有较强的抗动脉血栓形成作用，明显抑制血小板聚集功能是其抗血栓形成的机制之一。灯盏花颗粒在体内外均明显抑制AA、ADP及PAF诱导的血小板聚集作用，同时还显著减少电刺激大鼠颈动脉血栓形成作用，提示灯盏花颗粒具有明显的活血化瘀及通脉作用。在结扎颈外动脉的条件下，用二道血流速度流量仪超声探头于近头端测定正常的颈总动脉血流量，此时，颈总动脉的血流量主要反应脑血流量。灯盏花颗粒可明显增加大鼠脑血流量，提示灯盏花颗粒具有增加脑组织血供作用。灯盏花颗粒能明显延长小鼠断头后喘气时间，提示本品具有抗脑组织的缺血、缺氧作用。综上所述，云南植物药业有限公司研制的灯盏花颗粒具有显著的通脉及改善脑组织的缺血和缺氧作用，对缺血性脑组织具有明显的保护作用。本试验为灯盏花颗粒的临床应用提供了药效学试验依据。

    参考文献

    1 国家医药管理局中药情报中心站.植物药有效成份手册.第二版.北京:人民卫生出版社，1986，946.

    2 Ogletree ML.Overview of physiological and pathophysiological effects of thromboxane A 2 .Fed Proc，1987，46:133.3 陈奇.中药药理研究方法学.北京:人民卫生出版社，1993，538，783-785.

    4 Born GVR.Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal.Nature，1962，194:927.

    5 Peter AC，Richard WF，Fiona B，et al.Evaluation of a low molecular weight modulator of human plasminogen activator inhibitor-1activity.Thrombosis and Haemostasis，1996，75:808.

    6 Colman RW.Evaluation for potency of platelet inducers.Thrombosis and Haemostasis，1982，390.

     7Vermylen J，Badenhorst PN，Deckmyn H，et al.Normal mechanisms of platelet function.Clinics in Haematology，1983，12:107.

    8Vargaftig BB，Chignard M，Benveniste J.Present concepts on the mechanisms of platelet aggregation.Biochem Pharmacol，1981，30:363.

    9 贺师鹏.黄酮类化合物抗血小板活化机制研究.北京医科大学学报，1982，14:253.

    作者单位:650031云南昆明昆明医学院生理教研室