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Preparation and therapeutic effects of antioxidant catechin microcapsules on rats with nephrotic syndrome
Tian Yun，Lu Xiangyang，He Xiaojie，et al.
The Lab of Biochemistry&Fermentation Engineering，Hunan Agricultural University，Changsha410128.
【Abstract】 Objective To research the antioxidant capacity of catechin，prepare the microcapsules and study on the therapeutic effects of catechin microcapsules on rats with nephrotic syndrome.Methods Chemiluminescence was used to research the scavenging capacities on reactive oxygen of some natural plant antioxidants.Spray drying was applied to prepare microencapsulated catechin.The acute and subchronic toxicity tests were applied to evaluate the safety of microencapsulated catechin.The24h urinary proteins were detected by Commassie brillant blue.A semi-quantitative score was used to evaluate the degree of glomerular and tubulointerstitium lesions.Results The IC 50 of scavenging O 2 · - for catechin，the extraction from rosemary and grape seed were separately6.16，184.29and15.86μg/mL:The IC 50 of scavenging·OH were separately0.59，39.89and2.93μg/mL;The IC 50 of scavenging H 2 O 2 were separately0.69，16.80and1.34μg/ml.It was the strongest that the capacities on scavenging three reactive oxygens of catechin.The optimum technological parameters which prepared microencapsulation of catechin in spray drying were as follows:The concentration of slurry was25%;the ratio of sodium catechins and wall material was6∶4;the ratio of ethyl cellulose and polyethylene glycol was8∶2.The microencapsulated catechin had actually no toxici-ty.At the end of the experiment，the excretions of24h urinary proteins were separately nephrotic group，catechin-treated group，dexamethasone-treated group，microencapsulation of catechin-treated group and control group;the renal pathologic scores were separately nephrotic group，catechin-treated group，microencapsulation of catechin-treated group，dexamethasone-treated group and control group.the excretions of24h urinary proteins were positively correlated with the renal pathologic scores（r=0.827，P<0.01）.Conclusion The effects which microencapsulation of catechins in spray drying slowed chronic progressive kidney lesions through decreasing the excretions of24h urinary protein were better than those of free catechins.
【Key words】 catechin antioxidant capacity nephrotic syndorme rat
当前各种广泛使用的合成抗氧化剂由于其潜在的安全隐患等逐渐受到人们的排斥，从植物中寻找天然、高效、低毒抗氧化剂成为现代食品、医药和保健行业的重要课题之一。但天然植物抗氧化剂在自然条件下容易失去抗氧化生物活性，使之应用受到了较大的局限 ［1］ 。肾病综合征（nephrotic syndrome，NS）是原发性肾小球疾病的常见表现，活性氧（reactive oxygen species，ROS）在其发生发展中起着十分重要作用 ［2］ 。寻找一种天然高效抗氧化剂，辅助激素治疗途径，缩短治疗时间、降低糖皮质激素引起的副作用已成为目前临床肾脏病工作者的重要课题之一。本研究围绕肾病综合征的发生与活性氧自由基的关系以及天然植物抗氧化剂清除活性氧的特性，对天然植物抗氧化剂抗氧化活性进行评价基础之上，为克服儿茶素稳定性差、味涩、易受胃液pH环境影响以及脂溶性差而生物利用率不高的缺陷，进一步研究了儿茶素微胶囊的制备技术，通过微胶囊化来增加儿茶素的稳定性和生物有效性，最后通过肾病动物模型试验观察儿茶素微胶囊对肾病大鼠的疗效，为利用儿茶素防治临床肾病综合征提供了理论与试验依据，拓宽了儿茶素的应用范围。
1 材料与方法
1.1 材料 儿茶素（≥70%）、葡萄籽提取物（原花青素≥95%）购自湖南金农生物资源股份有限公司，迷迭香提取物（有效成分≥70%）购自云南玉溪绿健生物工程有限公司。昆明种小鼠、SD大鼠购自中国科学院上海实验动物中心。鲁米诺（色谱纯）由Sigma公司提供，血液生化指标测定试剂盒由北京中生北控生物科技有限公司提供（批号:0301137）。BPCL（-2-GC）微弱发光测量仪及BPCL App1.8.0数据处理站为中科院生物物理研究所产品，LPG-5高速离心喷雾干燥机为常州市干燥设备厂，高效液相色谱仪、SPD-10AP紫外检测器、LC-10AT VP泵、Class-VP色谱工作站、C18液相色谱柱均为日本Shimadzu公司产品，S-570扫描电子显微镜（SEM）、7170型全自动生化分析仪均为日本HITACHI公司产品，双目显微镜为日本OLYMPUS公司产品。
1.2 方法
1.2.1 抗氧化活性评价 化学发光法清除O 2 ·- 能力测定:在样品池内加入一定浓度梯度的样品水溶液50μl（以蒸馏水做空白对照），然后加入1mmol/L邻苯三酚10μl、鲁米诺-碳酸缓冲液（pH10.2）940μl，充分混匀后，立即启动化学发光，记录30s内化学发光动力学曲线。清除·OH能力测定:在样品池内加入一定浓度梯度的样品水溶液50μl（以蒸馏水做空白对照），然后加入1mmol/L CuSO 4 溶液50μl、1mmol/L1，10-菲罗啉溶液50μl、硼酸-硼砂缓冲液700μl（pH9.0），充分混匀，然后再加入100μl1mmol/L抗坏血酸溶液和50μl0.15%H 2 O 2 溶液，立即启动化学发光，记录240s内化学发光动力学曲线。清除H 2 O 2 能力测定:在样品池内加入一定浓度梯度的样品水溶液50μl（以蒸馏水做空白对照），然后加入15%H 2 O 2 溶液50μl、鲁米诺-碳酸缓冲液（pH9.5）900μl，充分混匀后，立即启动化学发光，记录60s内化学发光动力学曲线。根据参考文献 ［3］ ，用发光抑制率为50%时的样品浓度 IC 50 来衡量样品对活性氧的清除能力。
1.2.2 微胶囊制备及其超微结构观察 微胶囊制备过程:将乙基纤维素和聚乙二醇用酒精混合溶解并形成具有一定粘度的溶液，再将溶解好的儿茶素分散于壁材溶液中，用高速分散均质机均质，然后高速搅拌使整个悬浮液保持均匀状态，引入喷雾干燥机进行喷雾干燥。喷雾干燥条件为:进风温度130℃左右，出风温度95℃左右，进料速度9～10rpm。儿茶素含量测定:高效液相色谱法。精密称取适量微胶囊，用少量水洗去表面儿茶素或置研钵中加少量蒸馏水研磨成糊状并浸提24h，过滤并定容100ml;适量原料直接用水溶解并定容至100ml，用高效液相色谱分析儿茶素含量。色谱条件为:色谱柱:Nova-Pak C 18 （3.9×150mm）;流动相:N，N-二甲基甲酰胺-甲醇-冰醋酸（80∶4∶3）;二元梯度洗脱（A相为超纯水，B相为流动相）:B相比例由初12%经20min变为30%;紫外检测波长:278nm;柱温:35℃;流速:1.0ml/min;进样量:10μl。微胶囊产率=产品中儿茶素总含量/加入到悬浮体系中的儿茶素含量×100%;微胶囊效率=（1-产品表面的儿茶素含量/产品中儿茶素总含量）×100%。微胶囊超微结构观察:扫描电镜（SEM）法 在SEM样品台上贴一层双面胶，将充分混匀的微胶囊粉末撒在双面胶上，稍加压实，使一部分粉末陷入双面胶中，用刀片轻刮粘在双面胶上的微胶囊化儿茶素粉末，然后轻轻吹去多余的粉末，喷金，用SEM观察，选择具有代表性的视野进行拍照。
1.2.3 儿茶素微胶囊的安全性评价 急性毒性试验:改良寇氏（Karber）法 ［4］ 。根据最高致死剂量与最低致死剂量和计算公比将大鼠和小鼠随机各分成五组，每组10只，雌雄各半并分笼饲养。给药前大、小鼠隔夜禁食16h，自由饮水。给药时等容积五个不同浓度梯度灌胃给药，小鼠0.4ml/20g·bw，大鼠2.0ml/200g·bw，灌胃后立即观察动物进食、活动、毛发、粪便等行为学活动情况，连续观察14天，记录动物毒性反应情况和死亡动物分布。LD 50 测定方法采用Bliss法。亚慢性毒性试验:大鼠十二周饲喂试验 ［4］ 。将健康SD大鼠80只随机分成儿茶素微胶囊高（1/5LD 50 ）、中（1/10LD 50 ）、低（1/25LD 50 ）三个剂量组（1230mg/kg·bw·d、610mg/kg·bw·d和240mg/kg·bw·d）和生理盐水对照组共四组，每组20只，雌雄各半并分笼饲养。每天给药1次，连续给药12周，观察临床反应。停药后24h杀鼠采集血样，用试剂盒检测血常规、肝肾功能等生化指标，取内脏进行形态学与组织学检查。
1.2.4 儿茶素微胶囊对大鼠肾病综合征的疗效评价 将200只SD雌性大鼠（不包括试验过程中因操作或过敏等造成死亡的大鼠数）随机分成对照组、肾病组、激素治疗组、儿茶素治疗组、儿茶素微胶囊治疗组。实验第一天对照组尾静脉一次注射0.1ml生理盐水，其它各组尾静脉一次注射阿霉素（5mg/kg）。激素治疗组自实验第二周末皮下注射地塞米松（1.8mg/kg·d）至第六周末实验结束。儿茶素治疗组自实验第二周末行儿茶素灌胃（50mg/kg·d）至第六周末实验结束。儿茶素微胶囊治疗组自实验第二周末行儿茶素微胶囊灌胃（50mg/kg·d）至第六周末实验结束。在实验初、第2周末、第4周末和第6周末分别收集24h尿标本备用;收集肾脏标本，用福尔马林固定用于光镜检测。应用考马斯亮蓝法测定不同时期24h尿蛋白排泄量，采用半定量评分法分别对肾小球、肾小管间质的病理改变进行计分评价 ［5］ 。肾小球病理损害程度的评定:a系膜细胞增生按每个系膜区系膜细胞数目小于3个，3个，4个及大于5个等四种情况分别计0分，1分，2分，3分;b系膜基质增宽程度与毛细血管腔直径及开放程度相比，按毛细血管腔开放良好，基质未见明显增生;基质增生略小于毛细血管腔直径且呈节段性分布;基质增生略大于毛细血管腔直径且呈弥漫性分布，毛细血管腔呈节段性开放不良;基质增生呈弥漫性分布，大部分毛细血管腔开放不良等四种情况分别计0分，1分，2分，3分;c硬化;d基底膜的改变情况;e囊壁粘连情况;c、d、e按病变范围未见明显改变，病变范围小于30%，病变范围在30%～60%之间，病变范围大于60%等四种情况分别计0分，1分，2分，3分。肾小管间质病理损害程度的评定:根据肾小管扩张程度、肾小管萎缩程度、肾小管间质细胞空泡变性程度、肾小管间质细胞坏死程度、间质纤维化程度及肾间质炎症细胞浸润程度的无、轻、中、重分别计0分，1分，2分，3分。
1.2.5 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件包进行统计学处理，所有资料均采用ˉx±s表示;多组资料间和同组多个时点资料间比较，方差齐者，采用One-Way ANOVA分析，组间两两比较采用LSD法，方差不齐者，采用Tamhane分析，对有相关趋势的变量采用Pearson相关分析;以α=0.05（two tailed）作为检验水准，P<0.05为差异有显著意义。
2 结果
2.1 不同植物抗氧化剂体外清除活性氧能力 研究结果表明（见表1）:同一植物抗氧化剂对不同活性氧具有不同的清除能力，不同植物抗氧化剂对同种活性氧也具有不同的清除能力。儿茶素清除O 2 ·- 、·OH和H 2 O 2 的IC 50 分别为6.16、0.59和0.69μg/ml，其清除·OH和H 2 O 2 的能力较强且差异不大，而清除O 2 ·- 的能力稍弱;迷迭香提取物清除·OH和H 2 O 2 的IC 50 分别为184.29、39.89和16.80μg/ml，其清除H 2 O 2 的能力最强，清除·OH的能力次之，清除O 2 ·- 的能力最弱;葡萄籽提取物清除·OH和H 2 O 2 的IC 50 分别为15.86、2.93和1.34μg/ml，和迷迭香提取物的清除效果类似，其清除H 2 O 2 的能力最强，清除·OH的能力次之，清除的能力最弱，只是其清除能力均比对应的迷迭香提取物要强得多。供试的三种天然植物抗氧化剂中，儿茶素对活性氧清除能力最强，其清除O 2 ·- 的能力为迷迭香提取物的30倍，为葡萄籽提取物的2倍多;清除·OH的能力为迷迭香提取物的60多倍，约为葡萄籽提取物的5倍;清除H 2 O 2 的能力约为迷迭香提取物的25倍，葡萄籽提取物的2倍。
表1 植物抗氧化剂清除活性氧能力比较 （略）
葡萄籽提取物 15.86±0.07 2.93±0.05 1.34±0.03 2.2 儿茶素微胶囊的制备 从固形物含量、芯材与壁材的比例以及壁材的组成对儿茶素微胶囊产品质量的影响中看出（表2～4），随着固形物含量的增加，微胶囊产品的产率和效率均有所上升，但是当固形物含量过高时，进料粘度的增大会增加料液的雾化困难，并使喷头发生堵塞等现象。综合微胶囊产品质量的各项指标，固形物含量以25%为宜。芯材与壁材比例的提高，对微胶囊产品的产率和水分含量影响较小，但流动性显著增强，当芯材与壁材比例提高到7∶3时，产品效率下降很多，因此，芯材∶壁材以6∶4为宜。壁材组成的改变对微胶囊产品的产率影响不显著，但随着乙基纤维素的增加，微胶囊产品的效率和水分含量都表现为先上升后下降。但当乙基纤维素与聚乙二醇的比例提高到9∶1时，其流动性明显下降，故乙基纤维素∶聚乙二醇以8∶2为宜。
表2 固形物含量对微胶囊产品质量的影响 固形物含量（略）
表3 儿茶素包埋量对微胶囊产品质量的影响（略）
表4 壁材组成对微胶囊产品质量的影响 乙基纤维素（略）注:“-”表示流动性较差，“-”越多，表示流动性越差;“+”表示流动性较好，“+”越多，表示流动性越好
2.3 微胶囊超微结构 借助扫描电镜，可以看出利用喷雾干燥法所制备的微胶囊产品不是完全均匀一致，其为大小约在30～150μm之间较规则的球状颗粒（图1）。产品表面光滑完整、无裂缝，略有凹陷（图2），而凹陷为喷雾干燥微胶囊化产品普遍所具有的特征。微胶囊囊壁的局部结构表现为致密的整体结构（图3），说明该产品具有较好的包埋效果。
2.4 儿茶素微胶囊安全性评价 儿茶素微胶囊急性毒性试验结果:大、小鼠均没有表现出明显的中毒症状;儿茶素微胶囊对大鼠的LD 50 为6110mg/kg，对小鼠的LD 50 为5090mg/kg。根据急性毒性分级标准，儿茶素微胶囊属实际无毒级。
图1 微胶囊超微结构
图2 微胶囊表面结构
图3 微胶囊囊壁结构
儿茶素微胶囊亚慢性毒性实验结果:各组大鼠在试验期内活动、饮食、粪便和皮毛光泽等均未见异常;实验末各组大鼠肝功能、肾功能、总胆固醇、红细胞计数、白细胞计数等均无统计学差异（P均>0.05）（见表5），其主要脏器系数（g/100g体重或mg/100g体重）差异亦无显著统计学意义（P均>0.05）（见表6）;剖检及光镜镜检均未发现实质性病变及有意义的变化，表明儿茶素微胶囊不会造成明显的病理损伤。
2.5 儿茶素微胶囊对肾病综合征大鼠蛋白尿及病理损害的影响 实验初，各组大鼠尿蛋白排泄量无明显差别（P均>0.05）。阿霉素造模后，在第二周末均出现了大量蛋白尿，经电镜检测，肾小球基底膜可见足突广泛融合，说明阿霉素肾病模型制备成功。随着周龄的增长，对照组尿蛋白的排泄量逐渐增加，从第二周末始，其它各组大鼠24h尿蛋白排泄量均较同时期对照组要高（P均<0.01），差异有非常显著意义，见表1。实验第四周末，除对照组外，其 它各组大鼠24h尿蛋白的排泄量均高于激素组，差异有非常显著意义;与肾病组相比:其它各组大鼠24h尿蛋白的排泄量均有不同程度降低，差异有非常显著意义。实验末，各组大鼠24h尿蛋白的排泄量依次为:肾病组>儿茶素治疗组>儿茶素微胶囊治疗组>激素治疗组>对照组。儿茶素微胶囊治疗组与儿茶素治疗组24h尿蛋白的排泄量在第四周末差异无显著意义，但在第六周末差异显著（P<0.05）。实验第四周末，与肾病组相比，激素组大鼠病理积分降低，差异有非常显著意义（P<0.01），见表8。与激素组相比，微胶囊组大鼠病理积分虽然增高，但并没有统计学意义。实验第六周末，各组大鼠病理积分由高至低依次为:对照组、肾病组、儿茶素组、微胶囊组、激素组。与肾病组相比，激素组与微胶囊组大鼠病理积分明显降低，差异有非常显著意义（P均<0.01），与激素组相比，儿茶素组及微胶囊组大鼠病理积分均增高，差异有显著意义（P分别<0.01、0.05），具体见表8。经相关分析发现:24h尿蛋白排泄量与肾脏病理积分呈高度正相关（r=0.827，P<0.01）。说明儿茶素微胶囊可以通过降低尿蛋白的排泄量，来减轻肾脏损害，延缓肾脏病理慢性进展。
3 讨论
近二十多年来抗氧化剂的研究与应用取得了飞速的发展，各种广泛使用的合成抗氧化剂由于其潜在的安全隐患等逐渐受到人们的排斥，从植物中寻找天然、高效、低毒抗氧化剂成为了目前抗氧化剂发展的一个必然趋势。从目前的研究来看，天然植物抗氧化剂中绝大部分都是多酚类物质，其中应用得较好的有儿茶素、葡萄籽提取物、迷迭香提取物等。本研究通过体外抗氧化试验表明:儿茶素对三种主要活性氧的清除能力均比葡萄籽提取物和迷迭香提取物要强。但是，儿茶素分子中的酚羟基很活泼，在外界条件下极不稳定，容易因发生氧化、聚合或缩合等反应，而失去部分抗氧化活性及其它生物学功能 ［6］ ，且非保护状态下，其在体内的生物利用率也很低。为了有效解决这一问题，本文利用喷雾干燥法将其制备成微胶囊，并对制备工艺进行了初步探索（2004年8月25日申报国家发明专利，2004年10月22日通过初审，申请号:200410046696.8）。通过电镜观察及安全性评价，所制备的儿茶素微胶囊不仅具有较好的包埋效果，而且属于实际无毒级、无任何毒副作用，表明其可应用于临床研究。大量蛋白尿是肾病综合征的主要临床表现，持续大量蛋白尿可导致肾脏持续损伤，从而引起肾脏慢性进行性损害，因此有效控制蛋白尿的排泄是治疗肾脏病的根本所在 ［7］ 。另外，活性氧自由基的过量积聚也是造成肾脏病慢性进展的重要原因 ［2］ 。目前临床上治疗肾病综合征的首选药物是糖皮质激素，然而大量的研究发现若长期使用糖皮质激素可使肾小球入球小动脉阻力下降，肾小球内压力增加，改变肾小球对大分子物质的通透性，增加尿蛋白的排出，加速肾脏的损伤 ［8］ 。近年来，国内也有学者研究发现糖皮质激素不仅可使患者尿蛋白增加，尚可引起肾小球滤过率和有效肾血浆流量增加 ［9］ 。因此，寻找一种替代或辅助激素治疗途径，缩短治疗时间、降低糖皮质激素引起的副作用已成为目前临床肾脏病工作者的重要课题之一 ［10］ 。本课题组通过儿茶素对大鼠肾病综合征防治机制的研究发现:儿茶素对于防治肾小球疾病的慢性进展具有较好的作用.通过进一步系统研究，观察儿茶素微胶囊对肾病综合征大鼠蛋白尿和肾脏病理积分的影响发现:儿茶素治疗组、儿茶素微胶囊治疗组和激素治疗组均可在一定程度上降低蛋白尿排泄和肾脏病理积分，但又存在一定差异，与游离儿茶素治疗组相比，儿茶素微胶囊治疗组的疗效更好。这可能与儿茶素微胶囊在大鼠体内的稳定性和生物利用率比游离儿茶素要好有关。这些研究结果为利用儿茶素微胶囊防治临床肾病综合征提供了理论与试验依据，也为研发肾病治疗药物提供了一条新的途径。
表5 儿茶素微胶囊对大鼠血液生化指标的影响 （略）注:与对照组比较，其它各组P均>0.05
表6 儿茶素微胶囊对大鼠脏器系数的影响 （略）注:与对照组比较，其它各组P均>0.05
表7 五组大鼠不同时期24h尿蛋白的排泄量 （略）
表8 五组大鼠不同时期肾脏病理积分 （略）
参考文献
1 Chen K，Plumb GW，Bennett RN，et al.Antioxidant activities of ex-tracts from five anti-viral medicinal plants.J Ethnopharmacol，2005，96:201-205.
2 Nakakura H，Ashida A，Hirano K，et al.Oxidative stress in a rat model of nephrosis can be quantified by electron spin resonance.Pediatr Nephrol，2004，19:266-270.
3 王少敏，李萍，赵明强.生物化学发光法测定酸枣仁的抗氧化活性.中草药，2003，34:417-419.
4 张均田.现代药理实验方法（下册）.北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1998，1810-1827.
5 何小解，易著文，何庆南，等.儿茶素对肾病大鼠血浆及肾皮质内皮素、一氧化氮表达影响的研究.中华儿科杂志，2002，40:550-554.
6 杨贤强，王岳飞，陈留记.茶多酚化学.上海:上海科学技术出版社，2003.
7 陈述枚，莫樱.持续性大量蛋白尿在小儿肾病慢性进展中的作用.中国实用儿科杂志，2002，17:520-522.
8 Leonard MB，Feldman HI，Shults J，et al.Long-term，high-dose glucocorticoids and bone mineral content in childhood glucocorticoid-sensitive nephrotic syndrome.N Engl J Med，2004，351:868-875.9 莫樱，陈述枚.糖皮质激素加重某些肾病综合征蛋白尿的机制探讨.中华儿科杂志，1998，36:753.
10 叶建伟，丁洁，黄建萍，等.糖皮质激素受体基因多态性与肾病综合征患儿激素耐药相关性探讨.中华儿科杂志，2003，41:661-665.
基金项目:国家“十五”科技攻关计划资助项目（NO.2001BA535C）;湖南省教育厅重点计划资助项目（NO.02A015）;湖南农业大学后备人才创新团队建设基金
作者单位:1410128湖南长沙湖南农业大学生化与发酵工程实验室
410011湖南长沙中南大学湘雅二医院小儿肾病研究室