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1 理想的移植细胞
通过有效的细胞移植代替受损坏死的心肌细胞，恢复心肌细胞的绝对数量和质量，从而恢复心功能，是治疗心梗、心力衰竭的最具有挑战性、最理想的方法。现以证明，干细胞具有自我复制和跨系统分化潜能，能在特定条件和微环境下分化成有功能的心肌细胞，是心肌细胞再生的理想种子细胞。目前用于移植的干细胞主要由骨骼肌干细胞、骨髓干细胞、胚胎干细胞和外周血干细胞等。骨髓干细胞因采集方便、并且取自自身，因此没有排斥反应，也避免了伦理学纠纷而具有特殊的优势。
1.1 骨髓干细胞的研究概况 1968年，Friedenstein等 ［1］ 最早证明了骨髓基质干细胞的存在。他们在骨髓培养时，获得了一些贴壁细胞，这些细胞能在体外分化为骨和软骨组织。针对Friedenstein的观察结果，1985年，Piersma等 ［2］ 对此进行了深入的研究，发现骨髓基质干细胞可分化为成骨、软骨、脂肪以及肌组织。1995年，Wakitani等 ［3］ 发现:经5-氮胞苷和两性霉素处理后，骨髓基质干细胞在体外可以分化为肌细胞，并能融合成肌管，自主跳动。1999年，Makino等 ［4］ 在体外用5-氮胞苷诱导骨髓基质干细胞，发现部分细胞可以分化为具有自律性收缩性特点的心肌样细胞，1周后细胞间可以相互联结，形成肌管样结构，2周后可以自主跳动，3周后可以协同搏动。通过对心肌特异性标志物的检测，他们发现诱导后的骨髓干细胞可以被肌浆蛋白、肌球蛋白等的特异性抗体染色;电镜检测发现这些细胞具有心肌样结构;它们还有类似窦房结的电活动;在结构基因的表达等方面，诱导后的骨髓基质干细胞和胎心室肌细胞相似。2001年8月，德国Strauer等 ［5］ 进行了首例经冠脉人自体骨髓单个核细胞移植治疗心梗的研究，在患者心梗后6天，将这种细胞通过导管移植入梗死相关冠状动脉，10周后，分别通过静脉和运动状态下 201 铊心肌灌注扫描，多巴胺心脏超声负荷试验，右心导管和放射性核素心室成像等检测。结果，梗死面积从24.6%下降至15.7%，射血分数、心脏指数、每搏量增加了20%～30%，运动时的舒张末期容量下降30%，左室充盈压相对下降。首次证明了经冠脉内输入自体骨髓单个核细胞治疗急性心梗是安全可行的 ［6］ 。
1.2 骨髓基质干细胞（MSCS）的表面标志 MSCS的细胞表面标志有助于对不同的基质细胞系及不同分化阶段的基质细胞进行鉴定和纯化。但是，MSCS表面标志由于细胞分离、培养方法和培养时间等的不同而有差异。Conger等 ［7］ 认为MSCS阳性表面标志是SH2、SH3、SH4以及一些黏附分子如I-CAM-1等。Pittenger等 ［8］ 认为人MSCS阳性标志是SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD1120a、CD124。Hung等 ［9］ 采用带3μm孔培养板的装置培养分离得到人MSCS，培养至第2代末时阳性表面标志是CD90（THY-1）、CD44、CD105、CD29、CD51。大鼠骨髓MSCS阳性表面标志是CD14、CD43、CD45和CD31等。
1.3 骨髓干细胞的分离 骨髓干细胞成份复杂，大体分为五种:骨髓单个核细胞群，骨髓基质干细胞，造血干细胞，边缘干细胞群（SP细胞）和特殊细胞群等。骨髓包含许多细胞，多半是血细胞和造血前体细胞，MSCS只占骨髓细胞的0.01%～0.001%，因此MSCS的分离更具有重要意义。常见分离方法是通过密度梯度离心骨髓细胞得到单个核细胞，根据MSCS的黏附特性，通过培养换液法移去包括血细胞在内的不贴壁细胞，然后结合单抗和流式细胞仪等技术分离纯化或鉴定MSCS。这种方法比较耗时，分离得到的MSCS往往是异质性的，且难以克隆。最近Hung等 ［9］ 研究发现通过一种带3μm微孔培养板的装置，可以快速有效分离得到相对同质的骨髓基质干细胞，利用这种方法可以不用percoll分离液及除去红细胞。培养1周后，留在培养板上的成纤维样细胞呈集落状生长，在适当条件下能保持不分化状态而增殖18代，有一致的表面标志。
2 干细胞移植的组织修复机制
关于骨髓干细胞改善心功能的机制目前尚未明确，可能机制:（1）干细胞在损伤心肌微环境的作用下，分化为心肌细胞、血管内皮细胞和血管平滑肌细胞，增加梗死区心肌细胞数量，并改善血供。（2）与宿主细胞建立电-机械耦合，参与心脏收缩。（3）分泌细胞因子。细胞分化不是单个细胞的孤立行为，是在一定条件下发生的。Liechty等 ［10］ 将人的骨髓基质干细胞进行宫内胎羊异种异体移植，发现移植的细胞位点专一性地分化为软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、胸腺细胞。表明骨髓基质干细胞在异基因动物仍然能够存活，并环境依赖性地分化为不同组织细胞，而分化成什么样的细胞，取决于骨髓基质干细胞所在的组织微环境。Orlic等 ［11］ 则认为是骨髓基质细胞向心肌细胞分化的信号可能来自损伤的心肌，这些信号分子促进骨髓基质干细胞向心肌缺血坏死区域迁移、增殖和分化。干细胞因子（stem cell factor，SCF）作为c-kit的配体，被认为参与了造血干细胞和其它原始细胞向靶器官的迁移。在随后的研究中，Orlic等 ［12］ 用重组鼠SCF、重组人G-CSF（granulocyte colony stimulating factor）注射小鼠，9天后，超声心动图检测表明:心功能得到明显改善，梗死面积平均下降40%，死亡率下降68%。证实了SCF和G-CSF对骨髓间充质干细胞的迁移、聚集和促分化作用。其他作者 ［13］ 也认为，组织损伤所产生的炎症信号如TNF可能促进了干细胞向损伤局部的迁移和分化。
3 细胞移植的途径
目前，干细胞的心肌移植方式包括经冠脉输注、经心外膜心肌内注射、经心内膜行心肌内注射和经外周静脉输注。3.1 经冠状动脉 Wang等 ［14］ 将标记的大鼠MSCS经远端夹闭的升主动脉输注至左冠状动脉结扎后2周的同基因大鼠。输注即刻在冠状动脉毛细血管内有2%标记细胞，但梗死区无标记细胞。4周后，正常心肌内可见呈心肌样结构的标记细胞，与宿主细胞相连;在梗死瘢痕中发现呈成纤维细胞样的单个和成簇的标记细胞;同时标记的MSC也整合到心内膜、冠状动脉毛细血管内皮中。表明经冠状动脉注射MSC，可以通过血液循环到达心肌，并在不同环境中分化为心肌细胞、成纤维样细胞和内皮细胞。
3.2 经心内膜心肌内注射 Fuchs等 ［15］ 经动脉导管、然后经心内膜直接注射猪自身骨髓到缺血心肌中，结果发现心肌侧支灌流明显增加，局部功能明显增强，提示经导管心内膜输注细胞也是一种可行的方法。但较相关冠脉内注射操作繁琐。
3.3 直视下心肌内直接注射 目前绝大多数动物研究都采用此方式，方法可靠，效果理想。但因开胸创伤大，并发症多，不是一种理想的方法。然而，如果病人在施行CABG或其它心脏手术时，同时运用则不失为一种好方法。
3.4 经外周静脉输注 Kocher等 ［16］ 经尾静脉输注经G-CSF动员的成人骨髓中CD34 + 细胞至左冠状动脉前降支结扎的裸大鼠体内。2周后，发现梗死区微血管数以及Ⅷ因子阳性的血管干细胞数均明显增加;基质沉积和纤维化明显减少。只有梗死区和边缘区的新生血管增加。人源性毛细血管数占总数的20%～25%，输注CD34 + 细胞裸鼠的左室射血分数值增加了（22±6）%。同时发现新血管的生成减少了肥大心肌的凋亡以及心肌的重构。这种方法创伤小、操作便捷，但目前在缺血心肌治疗中的应用报道较少。有试验显示心梗后冠脉内注入带标记的骨髓干细胞，干细胞呈点状或线状分布在左冠脉供血的心肌各层，优于直接心肌注射 ［17］ 。冠脉内注射能获得最多数量干细胞。同时，干细胞定向分化为心肌细胞，需要一个比较固定的、有调控活性的微环境，称之为“龛”，它使细胞间保持的距离适合于细胞与细胞相互作用，适合于短距离调节因子的产生和传递，干细胞必须在“龛”内才能增殖，才能保持自我更新的特性，为了提供干细胞最多机会去寻找心肌中的“龛”，冠脉内注射是最佳选择 ［6］ 。经静脉输注干细胞适宜于不宜开胸和冠脉介入治疗的患者，但经静脉输注，只有梗死区和边缘区的新生血管增加，形态学尚未发现与宿主细胞发生电—机械耦合的结构部分。经静脉输注途径改善心功能有可能是干细胞与宿主细胞经相互作用产生旁分泌一系列营养因子所致 ［18］ 。
4 移植细胞类型
4.1 骨髓单个核细胞 Kamihata等 ［19］ 把猪的自身骨髓单个核细胞移植到缺血心肌，3周后局部血流和毛细血管密度明显增加（分别为4.6倍和2.8倍）。冠状动脉造影显示侧枝循环增加5.7倍。标记的骨髓单个核细胞整合到31%的新生血管中。
4.2 内皮祖细胞 Assmus等 ［20］ 研究小组将20例急性心梗后24h内行再灌注治疗（PTCA和支架术）的患者随机分为两组，冠状动脉内注射骨髓来源的内皮祖细胞组（n=9）和注射循环血来源的内皮祖细胞组（n=11）。随访4个月，两组患者左室射血分数明显增加，梗死区域室壁运动也明显增强，左室收缩末期容积显著减少，梗死相关动脉血流储备显著增加。
4.3 经不同处理的MSCS Tomita等 ［21］ 建立大鼠液氮冷冻心肌瘢痕模型，3周后在心肌瘢痕中心注射BrdU标记的新鲜采集的MSCS、培养7d的MSCS和经5-aza诱导的MSCS。5周后，发现3组大鼠心肌瘢痕中均有BrdU标记的心肌样细胞，表达肌钙蛋白和肌球蛋白重链，心肌瘢痕中毛细血管数均多于对照组，一些毛细血管内可见少量BrdU标记的内皮细胞。但只有5-aza诱导组才有心功能明显改善。
4.4 Lin（-）/c-kit（+）细胞 Orlic等 ［11］ 将标记的雄性小鼠的Lin（-）/c-kit（+）骨髓细胞输注到雌性成年小鼠缺血心肌的边缘区。9d后，12/30只小鼠有损伤心肌的修复，新生成的心肌占梗死区的68%。心肌细胞表达心肌特异蛋白和特异转录因子GATA-4，MEF2和Csx/Nks2.5以及提示细胞通讯的缝隙连接闰盘成分的连接蛋白43（connexin43）等。输注Lin（-）/c-kit（+）骨髓细胞的小鼠，左室舒张末压（LVEDP）下降36%，左室舒张压（LVDP）、LV+dp/dt、LV-dp/dt分别增加32%、40%及41%。
4.5 侧群细胞（SP细胞） SP细胞是骨髓中的CD34-/low/c-kit+/sca-1+造血干细胞。Jackson等 ［22］ 将雄性小鼠的SP细胞分离出来，经静脉注射给经射线照射的雌性小鼠。10周后，夹闭受鼠的左前降支冠状动脉60min后放开。2周、4周时，发现标记的SP细胞出现在心脏各种口径的血管中，以毛细血管居多。标记的血管占总血管数的3%，多在梗死边缘区。同时，SP细胞也整合到心肌细胞中，多出现在心肌瘢痕的边缘，平均占整个心肌细胞的0.02%。表明循环干细胞在心肌缺血发生时可以迁移到心脏中起修复作用。
4.6 动员的骨髓干细胞 Olic等 ［13］ 给急性心肌梗死小鼠注射SCF和G-CSF蛋白，发现27d后骨髓干细胞迁移至梗死部位，并分化成心肌细胞和内皮细胞，形成心肌、小动脉和毛细血管。小鼠死亡率减少68%，梗死面积减少40%，心室肿胀减少26%，心舒张压减少70%，射血分数增加，血流动力学指数得到显著改善。
5 移植细胞数量
由于移植的骨髓干细胞成分不同，因此所移植的细胞剂量也存在较大差异。移植骨髓单个核细胞或间充质细胞剂量在10 6 ～10 8 之间，最佳移植剂量为5×10 6［23］ ;但应用纯度高、相对均一的细胞群的剂量可低一些，Jackson等 ［22］ 移植SP细胞剂量为2000个。
6 干细胞移植的安全性
目前有关干细胞移植的安全性研究较少，但已有一些值得人们注意的问题:（1）骨髓干细胞可能增加肿瘤的发生。沙慧芳等 ［24］ 报道在骨骼肌损伤2h后注射骨髓间充质干细胞结果在局部形成肉瘤样组织。（2）经冠脉灌注的方法有形成心肌梗死及在冠脉内形成栓子的可能。最近有研究显示 ［25］ 在狗冠脉注射骨髓干细胞后可出现急性心肌缺血和亚急性心肌微梗死的现象。经冠脉内注射骨髓单个核细胞，虽可促进血管生成，改善心梗患者的心功能，但却加重冠脉血管重建术后的再狭窄 ［26］ 。（3）静脉输注可能会引起干细胞向其他脏器归巢 ［27］ ，导致其他不良反应。（4）移植细胞是否会分化为成纤维细胞而不是心肌细胞，导致不能形成有效电—机械耦合，而出现恶性心律失常?目前已有骨骼肌细胞移植后出现恶性心律失常的报道。
7 干细胞移植存在的问题与展望
7.1 人们还没有筛选出公认的骨髓间充质干细胞特征性的标志分子 各个研究小组报道的细胞是否为同一细胞（如CMG、Lin-/c-kit+）以及它们之间的区别和可能存在的联系，不排除这些细胞是同一种细胞的不同阶段的可能 ［28］ 。
7.2 骨髓干细胞移植最佳时间 目前研究较少，干细胞移植是否象血运重建一样越早越好?急性期有利于细胞归巢却容易导致移植细胞死亡，所以干细胞移植是选在有利于归巢的心梗炎症反应剧烈的急性期，还是在病理反应消退的时候，有待于进一步研究。
7.3 安全性仍是最需关注的问题 干细胞体外长期培养有可能获得永生型干细胞，与瘤细胞的恶性增生是否有相关联系应进一步明确。
7.4 研究中输注的细胞类型及途径呈多样性 如何选择适宜的细胞移植类型及途径，哪一种是最安全有效，目前尚缺 乏系统的研究。
总之，我们对干细胞的认识还处于蒙昧阶段，但随着深入研究，它或许成为一项能改变缺血性心肌病预后的全新治疗方法。
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作者单位:063000河北唐山华北煤炭医学院附属医院胸心外科