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Peng Lei，Wang Zhen，Xu Huazi，et al.
Osteopaedic Reseach Center The Second Affiliated Hospital The Wenzhou Medical College，Zhejiang325000.
【Abstract】 Objective To establish the HGPRT-defect osteosarcoma cell lineage，and determine the ability of sarcomagenesis and fusion.Methods N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine（MNNG）was used to induce the mutation of an osteosarcoma cell lineage（LM8），then culturing mixed with8-azaguanine killed those cells of HG-PRT positive，We got the HGPRT-defect osteosarcoma cell lineage LM9.The LM9cells were observed on cells biolo-gy characteristic such as morphous and cell cycles biology inoculated into mice and their growths were surveyed in the mice.Results The LM9cell lineage has typical characteristics of osteosarcoma cells and it is sarcomagenic to C3h mice.Conclusion The LM9cells lineage was obtained by method of mutation，it is typical of osteosarcoma cells characteristics and has a prospect of being used in tumor vaccine and other researches.
【Key words】 HGPRT-defect osteosarcoma cell lineage
肿瘤的免疫治疗是以激发和增强机体的免疫功能，以达到控制和杀灭肿瘤细胞的目的。常将其作为一种辅助疗法与手术、化疗、放疗等常规疗法联合应用。先用常规疗法清扫大量的肿瘤细胞后，再用免疫疗法清除残存的肿瘤细胞，可提高肿瘤治疗的效果 ［1］ 。建立各种肿瘤细胞系是研究肿瘤细胞生物学特性有力工具，本文构想建立一种HG-PRT基因突变型的骨肉瘤细胞系，它具有原亲本瘤细胞的免疫原性而在代谢上有较大的改变［2］ ，根据这一特性，可利用它更有效的进行细胞融合，筛选及制备肿瘤表面抗原多肽疫苗。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 骨肉瘤细胞 LM8细胞系购自Rich cell bank，系C3h鼠源性骨肉瘤细胞系，含100ml/L小牛血清的RPMI1640完全培养液放在37℃，50ml/L CO 2 孵箱中培养，对数生长期时，用2.5mg/L的胰酶（含2mg/L的EDTA）消化、离心、调整细胞数后传代、接种。
1.1.2 动物及饲养 4～6周龄C3h鼠8只（第四军医大学实验动物中心提供），雌性，体重17～25g。
1.2 方法
1.2.1 致突变及筛选 LM8系细胞取对数生长期1.0×10 6 /瓶，单层，培养基为RPMI1640，向瓶中加入2μg/ml的MNNG完全培养液作用15h后，除去致突变液，用PBS冲洗，胰蛋白酶（0.05%）+EDTA（0.02%）1:1混合消化，制备细胞悬液，接种1×10 3 /瓶，培养10天，细胞生长汇合后，传代，以3×10 3 数/瓶密度继续接种，24h后，向培养液中加10μg/ml的8-AG培养液，培养24h待细胞汇合，传代，更换不含8-AG的筛选液培养基继续培养，细胞接近半汇合时，冻存。
1.2.2 突变细胞系LM9鉴定 取对数生长期细胞LM8和LM9接种于培养瓶中，次日加入1%HAT完全营养筛选液，用倒置显微镜观察细胞的生长情况。
细胞形态观察:收集对数生长期细胞0.01M的PBS洗2次2000rpm×10min离心收集细胞，弃上清，以4%的pH7.4的戊二醛固定，按电镜标本常规制备方法，进一步固定，包埋，超薄切片，铅-铀染色JEM-2000型投射电镜观察。
1.2.3 细胞生长特征 调整突变细胞浓度按1×10 4 接种于24孔板，置37.5℃5%孵箱培养，每个样品重复3次，连续计数8天，以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞的生长曲线。
1.2.4 流式细胞仪分析细胞周期测定 培养细胞以0.1M PBS液（pH7.4）洗2次，悬溶于190μg结合缓冲液中调整细胞浓度为1×10 6 /ml，加10μl异硫氰酸荧光素（PTIC）标记的连接素（Amexin）和10μl的20mg/L的普匹碘氨（PI），混合均匀，避光室温孵育10min，结合缓冲液洗1次后用Couter Elite流式细胞仪（Coulter公司）进行分析细胞周期情况。
1.2.5 体内致瘤性观察 调整细胞浓度为5×10 5 接种于10只小鼠右下肢皮下待皮下出新肿瘤结节时，按文献 ［3］ 测量肿瘤大小并观察动物存活情况。
2 结果
2.1 HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞筛选 培养瓶中细胞经突变筛选后细胞呈明显多角形态，细胞个体大而丰满、整齐，有个别巨大的细胞，可见有核分裂相，细胞生长良好。
2.2 HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞形态特征 光镜下培养的细胞为多角形，核大可见分裂相，相差显微镜下细胞形态呈上皮样排列，生长的单层细胞有重叠生长的能力，细胞成圆形或椭圆形，核大，胞浆深染，且相对较少，核1～2个，细胞异型性明显，核丝分裂偶见，细胞呈弥散分布，组织属恶性肿瘤（图1）。
图1 细胞成圆形或椭圆形，核大，胞浆深染，且相对较少，核1～2个，细胞异型性明显，核丝分裂偶见（略）
2.3 HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞的超微结构 电镜观察细胞核大有异型性，核眼明显，染色质分散，稍聚于核膜，胞浆较长，富含线粒体、溶酶体、线粒体肿大并增多，少量的粗面内质网，胞浆内有丰富的游离核糖体，细胞间排列紧密，提示成骨细胞瘤的形态学特征（图2）。
图2 电镜观察细胞核大有异型性，核眼明显，染色质分散，稍聚于核膜，胞浆较长，富含线粒体，溶酶体，线粒体肿大并增多，少量的粗面内质网，胞浆内有丰富的游离核糖体，细胞间排列紧密（略）
2.4 HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞鉴定 加入HAT后 LM8细胞生长良好，呈对数生长，第四天达到高峰，LM9细胞在24h后即出现死亡，72h后细胞全部死亡。
2.5 HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞生长曲线 见图3。细胞第四天进入对数生长期，生长迅速。
图3 细胞的生长曲线（略）
2.6 HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞生长周期 流式细胞仪测得细胞G 1 =53.5，G 2 =19.5，G 1 /G 2 =1.837，为亚三倍体细胞，符合肿瘤细胞的特点。
2.7 HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞体内致瘤性 接种5×10 5 的HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞后肿瘤的生长如图4，小鼠体内14天时全部成瘤，成瘤率为100%，随着时间延长肿瘤体积不断增加。
图4 接种LM9细胞后C3h鼠肿瘤的生长情况（略）
3 讨论
肿瘤的免疫治疗是以激发和增强机体的免疫功能，以达到控制和杀灭肿瘤细胞的目的。虽然目前已经建立了多种免疫方法，但治疗的效果尚需进一步提高，给机体输入具有抗原性的瘤苗，刺激机体免疫系统产生抗肿瘤免疫以治疗肿瘤。该法应用的前提是肿瘤抗原能刺激机体产生免疫反应 ［4～6］ 。由于人肿瘤相关抗原的免疫原性很弱，不足以有效地刺激机体的免疫应答，因此单纯用自身或同种肿瘤细胞作瘤苗治疗肿瘤的效果不好。肿瘤免疫应答的主要效应细胞是TC细胞，TC细胞识别肿瘤表面的肽抗原（pep-tide）与MHCⅠ类分子的复合物，必需要有第二信号才能活化。这个第二信号可以由TC细胞表面的CD28分子与粘附分子B7的结合来提供。B7分子主要存在于活化的B细胞和抗原呈递细胞表面。大多数肿瘤细胞由于没有B7分子，因此肿瘤细胞虽具有肽抗原与MHCⅠ类分子的复合物，但由于不能提供第二信号，所以不能活化TC细胞 ［7，8］ 。因此肿瘤细胞与抗原提呈细胞的融合可以提供T细胞活化通路，这就为肿瘤疫苗的研制展示了光明的前景。
人和啮齿类细胞的HGPRT基因位于X染色体上，该基因在两性细胞中都呈半合子状态（单倍性），它的基因产物为次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT），由2～4个蛋白亚单位组成，该酶能促次黄嘌呤和鸟嘌呤与磷酸核糖焦磷酸（PRPP）间的转磷酸核糖基作用而生成一磷酸次黄苷（IMP），这是细胞合成的补救途径，但此酶特异性不强，也能把嘌呤拟似物6-巯基嘌呤（6-MP）和8-氮杂鸟嘌呤（8-AG）掺入DNA中引起细胞死亡，因此，当HGRPT基因突变时，细胞就表现为对6-MP或8-AG的抗性，在有6-MP或8-AG的条件下，它们能够生存，而野生型细胞即能够摄取6-MP或8-AG而死亡，以上特点是构成HGRPT突变细胞筛选的理论基础 ［3］ 。
本实验所筛选的突变细胞系，仍具有典型肿瘤细胞的生物学特性，细胞个体大而丰满，整齐，有个别巨大的细胞，可见有核分裂相，细胞生长良好。细胞核异型性明显，加入HAT后细胞在24h后即出现死亡，72h后细胞全部死亡。细胞周期G 1 /G 2 =1.837，为亚三倍体细胞，符合肿瘤细胞的特点。接种C3H小鼠体内14天后全部成瘤，成瘤率为100%。
HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞由于HGRPT表达缺失，对HAT不敏感，能用HAT筛选出来。因此，在骨肉瘤细胞的免疫治疗研究中可作为一种简便的分离筛选手段。这种筛选方法以用于骨肉瘤细胞的融和，以筛选杂交瘤细胞，导致免疫学特性的变化，将有利于肿瘤细胞的更进一步的研究及研制更为有效的杀灭肿瘤细胞的生物治疗方法。
参考文献
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* 基金项目:本课题受国家自然科学基金资助（项目编号:39970749）
作者单位:325000浙江温州温州医学院附属二院骨科
陕西西安第四军医大学西京医院骨科