点击显示 收起
1 材料与方法
1.1 试验药物及试剂 益气养阴活血中药复方主要由黄芪30g，淮山药15g，葛根15g，枸杞子15g，丹参15g，红花12g，麦冬15g，马齿苋15g等组成，组成药物均购自浙江省中医院中药房，由浙江中医学院制剂室制备成含生药4g/ml，4℃冰箱保存备用。链脲佐菌素（STZ）和免疫组化试剂盒均为Sigma公司产品。
1.2 动物分组及模型复制 健康雄性SD大鼠30只，清洁级，体重:200～250g，购自浙江大学医学院动物实验中心。适应性饲养1周后，将大鼠随机分三组:正常对照组、糖尿病模型组和益气养阴活血法治疗组，每组各10只，后两组大鼠空腹12h后腹腔注射pH4.4枸橼酸钠缓冲液配成的1.25%STZ，按50mg/kg剂量给药，正常对照组大鼠腹腔注射相同剂量的pH4.4枸橼酸钠缓冲液。3天后空腹血糖大于16.7mmol/L为糖尿病模型成功。益气养阴活血法治疗组每日灌服养阴活血降糖饮10ml/kg1次，正常对照组和糖尿病模型组每日灌服相同剂量的生理盐水。
1.3 免疫组织化学染色 大鼠采用2%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉后，立即开胸暴露心脏，经左心室插管，剪开右心房，快速灌注灭菌生理盐水300ml后，改灌注4%多聚甲醛500ml，断颈后打开颅腔完整取脑，浸入灭菌后的30%蔗糖PBS溶液过夜直到脑组织块下沉。取出脑组织块，冰冻切片机作连续切片，片厚20μm。按标准ABC免疫组化法操作，一抗为兔抗大鼠、小鼠等多克隆NT-3抗体（1:200），阴性对照组不加一抗，二抗为羊抗兔生物素化抗体（1:100）。
1.4 结果观察 每组动物各取8只，每只在相应的额叶部位连续切片，每隔三张取一张，共取15张切片，按照包新民图谱的B-1.0至B-1.6平面中的Prcl区，在装有目镜网格测微尺（80μm×80μm）400倍视野下计数每例切片10个网格的NT-3阳性细胞数，计算出每0.05mm 2 面积内的阳性神经元数目即阳性细胞密度。每张切片在相应部位在Olympus显微镜下拍照，用浙江大学医学院神经生物实验室开发的Static IMC2.0图像处理系统，测定每张切片随机选取的10个NT-3阳性细胞胞浆的算出每个阳性神经元的平均光密度，以反应染色深浅的程度。
1.5 统计学分析 本实验数据处理采用SPSS for Window10.0统计软件。计量资料数据以均数±标准差（ˉx±s）表示，组间显著性采用t检验。
2 结果
2.1 一般情况观察 糖尿病组大鼠反应明显迟钝，精神萎靡，多数时间趴着，毛色渐渐失去光泽，每天垫料要换数次、每次都湿透，体重也渐渐下降。治疗组大鼠反应较灵敏，毛色可，多尿、体重下降明显。正常对照组大鼠发应灵敏，警觉，好打斗，垫料换一次即可，体重增加。
2.2 各组大鼠额叶皮质NT-3免疫组化结果 正常对照组的Prcl区中的额叶皮质NT-3神经元数量多，染色深，锥体细胞顶树突明显，轮廓清楚;糖尿病组大鼠Prcl区中的额叶皮质NT-3神经元数量少（与正常组比较，P<0.01），染色浅，锥体细胞顶树突不明显;治疗组大鼠与正常对照组接近。目镜网格法测得的各组大鼠额叶皮质在400倍显微镜下NT-3阳性细胞密度及用Static IMC2.0图像处理系统测得的每个NT-3阳性神经元的平均光密度见表1，各组大鼠额叶皮质神经元免疫组化结果见图1、2、3。
表1 各组大鼠额叶皮质阳性细胞密度及阳性细胞的平均光密度 （略）
注:糖尿病模型组比较， △△ P<0.01
3 讨论
3.1 NT-3在糖尿病大鼠额叶皮质的表达 额叶皮质神经元与各叶皮质均有往返联系，额叶神经元通过抑制无关信息、选择性注意和语词输出等机制介入知觉型联想启动和知觉启动 ［1］ ，从而参与学习记忆过程。额叶皮质的神经元受损害所引起的知觉障碍称为不识症，对物体引起的触觉、视觉、听觉不能唤起记忆。糖尿病晚期病人常有认知功能障碍，主要表现为学习、记忆能力下降。许云祥等 ［2］ 通过水迷宫实验研究发现糖尿病大鼠也存在学习、记忆能力下降。
额叶皮质的神经元都是多极神经元，按其形态分为锥体细胞、颗粒细胞和梭形细胞。神经元是以分层方式排列的，一般可分为6层，从浅到深为:分子层、外颗粒层、外锥体层、内颗粒层、内锥体层和多形细胞层。本研究结果显示:NT-3阳性细胞在额叶皮质各层内弥散分布，但主要分布在皮质的外锥体层，阳性细胞主要是锥体细胞;与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠大脑皮质NT-3阳性神经元数量明显减少，染色变浅，表明糖尿病大鼠的额叶皮质表达NT-3的神经元发生了退行性变。
糖尿病大鼠额叶皮质神经元NT-3的表达减少可能 是由于NT-3的自分泌和旁分泌作用均减少引起的。作为神经营养因子效应细胞的神经元，其本身具有产生神经营养因子的能力，即神经营养因子的自分泌作用 ［3］ ，糖尿病病人出现高血糖的同时，存在脂代谢紊乱，血脂升高，导致血液黏度增高，高血糖高血脂可诱使动脉粥样硬化，产生微血管病变，从而引起脑缺血，脑细胞因缺血、缺氧而变性、坏死 ［4］ ，变性、坏死的神经元的自分泌作用减少。血管内皮细胞及少突胶质细胞等也因缺血、缺氧而变性导致它们的旁分泌作用也减少。总体上NT-3在糖尿病大鼠大脑皮质神经元的表达减少，这与本实验结果相符合。
3.2 养阴活血法对糖尿病大鼠大脑皮质NT-3表达的影响 糖尿病的病机进展是由阴虚而发展为气阴两虚，最终则阴阳两虚。初期是阴虚为本，燥热为标。中期是气阴两虚为本，湿痰瘀血为标。后期阴阳两虚是糖尿病发展的趋势，湿痰瘀血是合并症的主要原因 ［5］ 。气阴两虚为本，瘀血阻络为标。本实验选择了淮山药、葛根、黄芪等益气养阴治其本，丹参、红花等活血祛瘀治其标，标本兼治，从整体上调节体内的阴阳平衡。本实验结果发现:益气养阴活血法可以增加糖尿病大鼠额叶皮质神经元NT-3的表达。方中丹参、黄芪、葛根等具有抑制血小板聚集，降低血液黏度，减轻高凝状态，改善脑部的微循环，马齿苋具有降低血糖，保持血糖稳定的作用。现代药理学证实:黄芪中的黄芪多糖和黄芪总黄酮、枸杞子中的活性成分枸杞多糖和丹参中的活性成分丹参多糖均具有较高的清除氧自由基和抗氧化的能力 ［6］ ，它们具有延缓神经元衰老死亡的作用。从而使额叶皮质神经元的自分泌和神经胶质细胞等旁分泌均增加。而增加的NT-3又能降低细胞内活性氧的水平或改变活性氧组份比例起到保护细胞的作用，并通过影响细胞内多种蛋白酶、激酶及其复杂的信号传递系统来抑制细胞凋亡的过程 ［7］ 。总之，益气养阴活血法具有防治糖尿病大鼠大脑额叶皮质神经元退变的功能。
（本文图片见封三）（略）
参考文献
1 Gabrieli JDE，Poldrack RA，Desmond JE.The role of left prefrontal cor-tex in language and memory.Proceedings of National Academy of Sience in USA，1998，95:906-913.
2 许云祥，张家维，赖新生，等.电针对糖尿病大鼠学习记忆的影响.中国自然医学杂志，2003，5（1）:10-13.
3 Mller H W，Junghans U，Kappler J.Astroglial neurotrophic and neurite promoting factors.Pharmacol Ther，1995，65（1）:1-18.
4 盛树力.糖尿病脑病与老年性痴呆.中华内分泌代谢杂志，2001，1（1）:58-59.
5 方水林.中医药治疗糖尿病的思路简析.实用中医内科杂志，2003，17（6）:439.
6 汪长生，漾解人，桂常青，等.丹参注射液对大鼠急性心肌缺血及血液流变学的影响.中国临床药理学与治疗学，2003，7（1）:30-32.
7 郭雨霁，李盛芳.神经营养因子家族及其受体的研究进展.神经解剖学杂志，2001，17（3）:288-294.
作者单位:310053浙江杭州浙江中医学院