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进入20世纪90年代,HIV在我国迅速传播,感染人数成倍增长(据《全国艾滋病防治工作》1990年AIDS/HVI报告数2/299人,2002年AIDS/HIV1028/9732人,估计实际人数是报告人数的10倍)。HIV感觉的诊断以HIV抗体的检现为金标准,为了达到早诊断、早治疗、早管理的目的,全国先后建立了大量的HIV抗体初筛实验室。出于实验条件的限制,大部分实验室仅能做常规的HIV抗体初筛工作,很少对HIV病毒做深层次的研究。现简述我科用ELISA法检测HIV抗体的几点体会。
1 试剂方面
《全国艾滋病检测技术规范》(2003版)批准的初筛试剂有酶联免疫、颗粒凝集和其它快速诊断试剂。对于试剂本身的质量问题,试剂的稳定性、敏感性和特异性等指标,由于基层实验室不能得到血清转化盘和大量的阳性标本,不可能进行自己测定,只能看试剂厂家的批检报告和每年国家有关部门的临床评估报告,所以在购买试剂时索取和审查厂家提供的批批检报告至关重要。在操作中,试剂在测定前一定要在室温下恒温30min,如果不经过恒温过程,储存温度和室温的差异会使酶标板上凝集一些小水珠,也使开始反应的温度不恒定,影响到抗原抗体的结合与反应的速度。在储存上,一般在2~8℃,特别注意试剂盒不能紧贴冰箱储存室后壁摆放,否则试剂会被冰冻,复融后试剂的总体效价将严重偏低,不能使用。
2 样品方面
ELISA试剂对于样本要求不高。我们曾做了许多溶血、脂肪血和黄疸性血清以及加了EDTA抗凝剂的血浆样本,结果均为阴性,没有假阳性出现,说明一些生物因素和抗凝剂对阴性结果不产生影响,但所做均为阴性样品,而无阳性样品,各类因素是否会对阳性样品产生影响还有待探讨。值得注意的是,反复冻融的样品会使抗体的效价降低很多,甚至出现假阴性结果。我们曾经用同一批号的试剂对同一阳性样品反复冻融后测定,第1、2、3次冻融之间OD值下降很快,第4次测定已降至灰区,成为一个不确定样品。
3 所用仪器方面
ELISA方法所用仪器相对简单。洗板机的使用出现了这样的问题:洗板机的吸液针头要接触酶标板的板底才能吸干净,而触碰板底将会对包被物产生影响;手工洗板容易溢液和污染。我们做了手工洗板和机洗板的比较,除了手工洗板比机洗板空白值略低外,其它没有区别。用洗板机有3个地方要注意:(1)是洗两个不同厂家的酶标板时,应注意调整吸液头的下降高度,以免因高不适使冲洗针头卡住酶标板;(2)是当吸液针头有破损时,吸液端由平端变为尖锐,板底包被物被破坏可能性增加,对结果影响较大,应及时更换;(3)是溢液的问题,洗液不足洗不干净(特别是边缘残留的酶标物),洗液太多容易溢出,这就要求不断调整洗液量,洗不同厂家试剂的酶标板洗液量可以不同。移液器要按时校正;酶标仪效果将更好。
总的来说,ELISA试剂发展已相对成熟,对样本要求不高,只要注意其中的诸多影响因素,注意试剂的储存和仪器的保养,严格按照说明书操作,就可以避免出现假阴性。
作者单位:201500上海市金山区疾病预防控制中心