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【摘要】 目的 比较抗原修复对多聚甲醛固定脑组织冰冻切片免疫组化结果的影响。 方法 成年SD大鼠用4%多聚甲醛经心腔灌注、固定后，分别经15%及30%蔗糖梯度脱水后进行冰冻切片（10μm），取相同部位切片20张，用兔抗Ach-M 2 受体多克隆抗体和小鼠抗DA-D 2 受体多克隆抗体作S-P免疫组化染色。 结果 经抗原修复的冰冻切片组的阳性结果比未经抗原修复组有明显提高。 结论 本实验首次发现多聚甲醛固定的组织冰冻切片经抗原修复可以提高免疫反应敏感性或提升抗体效价。机制可能与多聚甲醛固定后对抗原有封闭作用有关。
【关键词】 冰冻切片;抗原修复;免疫组化
石蜡切片由于在制作过程中使用大量有机溶剂（酒精、二甲苯）和（或）包埋过程中加热处理使抗原活性丧失，所以通常采用抗原修复方法来提高石蜡切片免疫组化反应的敏感性。而对于冰冻切片的制作由于不经过上述过程，在以往的研究中通常不再经过抗原修复而直接做免疫组化。但用冰冻切片做免疫组化研究时通常采用多聚甲醛固定，众所周知多聚甲醛对抗原有封闭作用，并且在神经系统中由于抗原表达量较微量，造成免疫组化染色中需要配制较高浓度的抗体工作液，造成抗体消耗较大，染色效果不佳。因此本文采用抗原修复和不修复两组切片进行免疫组化染色，比较免疫反应敏感程度，以期进一步提高免疫组化反应的敏感性。
1 材料与方法
1.1 标本获取 成年健康SD大鼠（体重250g左右）用10mg/ml的戊巴比妥钠按40mg/kg腹腔麻醉后，用4%多聚甲醛经心腔灌注固定，取脑放入同等浓度多聚甲醛外固定48h，而后逐次进入15%及30%蔗糖内梯度脱水，制成10μm厚冰冻切片。取相同部位（前额叶皮质）切片20张随机分成2组，一组经0.6%的柠檬酸抗原修复液（pH6.0）高温高压修复5min，一组不经过修复。
1.2 免疫组织化学染色 两组切片再随机分成2组:两组分别用兔抗Ach-M 2 受体多克隆抗体和小鼠抗DA-D 2 受体多克隆抗体作S-P免疫组化染色:0.01mol/L PBS洗3min×3;内源性过氧化物正阻断剂15min;0.01mol/L PBS洗3min×3;正羊血清15min;甩血清，加1:1000浓度的兔抗Ach-M 2 受体单克隆抗体（CHEMICON）或1:30浓度的小鼠抗DA-D 2 受体单克隆抗体（三塔公司），4℃24h;0.01mol/L PBS洗5min×3;加Ⅱ抗15min;0.01mol/L PBS洗3min×3;加Ⅲ抗12min;0.01mol/L PBS洗3min×3;DAB（现用现配）显色10min;蒸馏水洗3min;裱片，梯度酒精脱水;透明;树胶封片。
1.3 结果观察 在Olympus显微镜下，分别观察（SD大鼠前额叶皮质）两组切片相同部位的Ach-M 2 受体和DA-D 2 受体免疫阳性物的分布。
2 结果
经0.6%柠檬酸抗原修复液（pH6.0）高温高压修复组的切片Ach-M 2 受体和DA-D 2 受体免疫阳性物分布比未修复组明显增多。（图1、2为Ach-M 2 受体;图3、4为DA-D 2 受体）。
3 讨论
众所周知，冰冻切片最突出的优点就是能够较完好地保存抗原的免疫活性 ［1］ ，即具有抗原敏感性高的优点 ［2］ 。因此对冰冻切片通常不进行抗原修复 ［3］ ，而在作免疫组化的研究时往往需要对组织进行固定，固定液（如多聚甲醛、福尔马林）使组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成醛键，使得不少抗原决定簇被封闭。同时，由于甲醛的聚合作用，使蛋白分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原有一定的封闭作用 ［4］ ，从而降低了抗原敏感性。考虑到以上原因，我们对冰冻切片进行高温高压抗原修复并作对比研究。
本研究结果首次发现多聚甲醛固定的大脑组织的冰冻切片经过抗原修复可以明显提高大脑组织受体免疫反应的敏感性或增加抗体工作效价，降低抗体消耗。
（本文图片略）
【参考文献】
1 蔡文琴，王伯云.实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术.成都:四川科学技术出版社，1994，17-18.
2 远山正弥.神经科学研究尖端技术手册-分子组化学.北京:科学出版社，1997，13-14.
3 熊正文，王炳胜.抗原修复技术在脱钙组织冰冻切片免疫组化染色中的应用.中国比较医学杂志，2004，14（3）:151-154.
4 熊正文.免疫组织化学中抗原修复的研究进展.中华病理学杂志，1997，26（1）:124-126.
基金项目:国家自然科学基金（No.39160076，30160027），云南省自然科学基金（No.2001C0048M）资助
作者单位:1 650031，云南昆明，昆明医学院法医学院
2 650031云南昆明，昆明医学院脑损伤研究室
3 650031云南昆明，昆明医学院组织胚胎学教研室
（编辑:一 坤）