点击显示 收起
1 仪器与试药
SQ250超声发生器（上海超声波公司）;CS-910型双波长薄层扫描仪（日本岛津）。冬虫夏草及哈士蟆油（广州药材公司）均经广东药学院生药教研室鉴定;腺苷对照品（上海生物化学试剂厂）;D-甘露醇（汕头市化学试剂厂）;其它试剂均为分析纯。
2 实验方法
2.1 均匀设计优化最佳提取条件 根据有关文献及预试验，确定如下考察因素及范围，见表1，按U 6 （6 6 ）设计实验表，见表2。 表1 因素水平因 素 表2 U 6 （6 6 ）实验表及优化条件下提取率
2.2 提取率 冬虫夏草及哈士蟆油粉末等量混合，按表2各试验号用超声波提取（乙醇为溶剂），然后按相同条件水提，水浴蒸干后，分别计算醇提取率及总提取率（总提取率=醇提取率+水提取率）。将各试验号数据输入计算机，求二次多项式回归方程，确定优化条件。
2.3 胶囊的制备 冬虫夏草及哈士蟆油的等量混合物，按优化条件醇、水提取并浓缩为稠膏，加入适量淀粉及糊精制粒，干燥后装胶囊，规格0.5g/粒。
2.4 质量标准
2.4.1 鉴别 供试品溶液的制备:胶囊4粒，加甲醇20ml加热提取，3000rpm离心20min，上清液蒸发至5ml。对照品溶液的制备:精密称取D-苷露醇对照品10.00mg，适量甲醇加热溶解，移至10ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，浓度为1mg/ml。薄层层析:采用硅胶G为吸附剂;乙酸乙酯-吡啶-水（7:4:1）为展开剂;供试品溶液及对照品溶液各5μl，点样上行展开;用0.5%高碘酸钾溶液和0.5%联苯胺乙醇溶液进行显色。
2.4.2 含量测定 （1）供试品溶液的制备:胶囊4粒，加无水乙醇20ml加热提取，3000rpm离心20min，上清液蒸发至2ml即得。（2）对照品溶液的制备:精密称取腺苷对照品10.00mg，用适量无水乙醇加热溶解，转移至10ml容量瓶中，加无水乙醇至刻度，浓度为1mg/ml。（3）薄层层析［7］ :硅胶GF 254 20ml加入0.05MNa 2 HPO 4 ·12H 2 O为吸附剂;用氯仿-乙酸乙酯-异丙醇-水（8:2:6:0.6）展开;扫描条件:反射法锯齿扫描确定λ S =260nm，λ R=290mm，狭缝1.25mm×1.25mm，灵敏度×1，纸速20mm/min，扫描速度20mm/min。（4）外标二点法测定样品含量:取对照品溶液1μl、3μl分别点于板左右两边，供试品溶液10μl点于板的中间，按上述条件测定各斑点的峰面积积分值A，按下面外标二点法公式计算供试品中腺苷含量。μg/g=［1/2（m 标1 /A 标1 +m 标2 /A 标2 ）×A 样 ］/m 样 ×V 定容 /V 点样m 标 :标准对照品含量（μg）; A:峰面积积分值 A 样 :样品含量（g） V 定容 :样品定容体积（μl） V 点样 :样品点样量（μl）
2.5 药理实验
2.5.1 试验样品的制备 冬虫夏草及哈士蟆油粉末，分别按优化条件醇、水提取，水浴蒸干。将醇、水提取物用水加热溶解后合并，最后定容至一定体积，得冬虫夏草及哈士蟆油试验样品液，二者浓度均为1g药材相当2ml样品液。胶囊用水加热溶解，并定容至一定体积，得到浓度为2ml样品液中含冬虫夏草及哈士蟆油各0.5g。
2.5.2 祛痰作用试验 18～22g健康小鼠50只随机分为5组，分别以生理盐水（N.S）0.1g/ml NH 4 Cl溶液，冬虫夏草样品液，哈士蟆油样品液及胶囊样品液按0.1ml/10g（5g/kg）灌胃给药，第1天给药2次，第2天给药30min后腹腔注射0.25%酚红溶液0.7ml/只，30min处死小鼠，检查祛痰作用。
2.5.3 免疫作用试验 18～22g健康雄性小鼠40只随机分为4组，分别以生理盐水，冬虫夏草样品液，哈士蟆油样品液及胶囊样品液按0.1ml/10g（5g/kg）灌胃给药，上、下午各1次，连续4天，第5天小鼠静注印度墨汁10ml/kg，通过比色计算廓清指数K值。
3结果与讨论
3.1 最佳提取条件 将表2中1-6试验号数据经计算即处理得二次多项式回归方程:Y=3.84×10 -3 +1.22×10 -4 B.D-1.30×10 -5 B.C+3.70×10 -2 A 2R=0.987 S=0.027 n=6 F=258>F 0.05 =19.2;回归方程显著，分析上述回归方程得醇提最优化条件为:A=3h，B=20%，C=205ml，D=13h。将此优化条件代入回归方程得理论醇提取率为55.0%，按优化条件进行实验，实际醇提取率为54.0%，与理论值基本相符。且从表2看出，优化条件下的醇提取率比任何一个实验号均高，说明优化条件可信。表2最后一项总提取率为醇提后按该试验号同样超声时间及体积以水提取后醇与水总提取率，同样， 优化条件具有最高总提取率。
3.2 超声法与渗漉法比较 按相同的优化条件（即浸泡时间、乙醇浓度、体积、渗漉时间均匀超声法相同），渗漉法结果见表2，结果表明渗漉法醇提取率及总提取率为12.5%及18.0%，均显著低于超声法。这主要是因为超声波振动能产生并传递强大能量，且具有空化作用，机械振动等 ［7］ 有利于有效成分转移，提高提取率。
3.3 质量标准
3.3.1 鉴别 图1为薄层鉴别图谱，供试品及D-苷露醇对照品在显色10min时均在对应位置上显相同鲜黄色斑点，实验表明，该显色斑点集中，R f 值适宜，显色灵敏，颜色稳定。展开剂:吡啶比例增加R f 值增大，水比例增大则相反。
3.3.2 含量测定 含量薄层扫描图谱见图2。经扫描测定，胶囊中腺苷含量为320.17±0.317μg/g（三批结果平均值），可作为胶囊含量控制指标。
3.4 药理实验
3.4.1 祛痰作用 见表3。图1 薄层鉴别图谱1.D-甘露醇对照品2.供试品 图2 薄层定量扫描图谱1.腺苷对照品2.供试品表3 冬虫夏草、哈蟆油、胶囊的祛痰及单核细胞吞噬功能作用 注:a ˇˇˇ 与N.S比较P<0.001;b ˇˇ 与N.S比较P<0.01 表3第4栏结果说明，与生理盐水比较，哈士蟆油、冬虫夏草、胶囊痰存在显著性差异，冬虫夏草的祛痰作用比哈士蟆油强。由于胶囊中冬虫夏草及的浓度均比它们单独应用时低1倍，说明二者合用具有一定的协同作用。
3.4.2 单核细胞吞噬功能作用 从表3第5栏看出，冬虫夏草能非常显著增加单核细胞吞噬功能，哈士蟆油也具有该作用，胶囊的显著性未达P<0.001的显著性水平，可能因为浓度较低所致。
参考文献
1 中华人民共和国药典.北京:化学工业出版社，2000.
2 江苏新医学院.中药大辞典，上海:上海人民出版社，1995，767.
3 杨世海.冬虫夏草研究新进展.中草药，1994，25（9）:488-492.
4 江苏新医学院，中药大辞典，上海:上海人民出版社，1995，1650-1651.
5 郭文场.哈蟆油的研究（二）.特产科学实验，1983，（3）:26:27.
6 方开泰.均匀设计-数改方法在试验设计中的应用.应用数学学报，1980，3（4）:365.
7 郭孝武.超声技术在中草药成分提取中的应用.中草药，1993，24（10）:548-549.
作者单位:510224广州广东药学院