点击显示 收起
关键词 尿嘧啶DNA糖基化酶 HBV DNA荧光定量PCR PCR污染 U-DNA模板
由于PCR技术高度敏感性，使PCR也特别易受到污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。污染的DNA可能有三个来源:测试样品之间的DNA污染、实验材料如重组质粒DNA、同一靶序列前一次PCR的扩增产物，其中最后一种最为严重麻烦。为了防止和消除污染，我们构建了尿嘧啶DNA糖基化酶 ［3］ 及模拟污染源的U-DNA模板 ［4］ ，并在HBV DNA核酸扩增PCR荧光定量检测试剂盒中应用 ［2］ ，极大地解决了PCR污染。我们在研究中对该酶的防污染体系进行了优化，使其更适合实验室应用。经过临床验证取得满意结果，报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 乙肝病毒HBV DNA核酸扩增PCR荧光定量检测试剂盒（华美生物工程公司提供）;尿嘧啶DNA糖基化酶（华美生物工程公司）;REINcolumn TM 琼脂糖DNA纯化系统（华美生物工程公司）;Du-530紫外分光光度计;ABI PRISM TM 7700荧光定量分析仪。
1.2 标本来源 从上海两家医院收集临床血清或血浆标本382份，编号后-20℃保存。其中HBsAg（+）、HBeAg（+）、HBcAb（+）的标本102份;HBsAg（+）、HBeAb（+）、HBcAb（+）的标本100份;HBV其他标志物阳性标本55份、其他肝病患者标本55份、临床用血标本70份。HBV国家定量标准品血清购自中国药品生物制品检定所。
1.3 模拟污染源的U-DNA模板的制备 取原始浓度为100fg/μl（T-DNA）的乙肝病毒DNA阳性重组质粒作为反应模板，用乙肝病毒核酸扩增PCR荧光检测试剂盒进行PCR（扩增产物量可达微克级）。将扩增产物电泳后用刀片切出，用REINcolumn TM 琼脂糖纯化系统提取纯化，获取U-DNA第一模板，该模板还含有1/10 7 的T-DNA。为进一步消除残留的T-DNA，将U-DNA第一模板继续进行10倍稀释，用乙肝病毒核酸扩增PCR荧光检测试剂盒进行PCR检测（灵敏度可达10 9 倍稀释度），将10 5 倍稀释度作为U-DNA的第二模板（该稀释度T-DNA的残留量约为原始浓度的1/10 12 倍，可忽略不计），进行PCR并对扩增产物进行提取纯化，最终获取U-DNA模板。用无菌去离离子水按1:50稀释后，用Du-530紫外分光光度计测260nm的OD值，计算U-DNA模板浓度并用乙肝病毒HBV DNA核酸扩增PCR荧光定量检测试剂盒定量。将U-DNA模板梯度稀释取含量为10 5 拷贝/ml的稀释度模板作为模拟污染源的U-DNA。为避免片段降解，不宜反复冻融，应及时分装成小包装。
1.4 尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）用量优化及验证 ［5］
1.4.1 UNG功能性试验1 分别在乙肝病毒HBV DNA核酸扩增PCR荧光定量检测试剂盒反应主混合液中加入0U，0.3U，0.6U，0.9U，1.2U，1.5U的UNG，对HBV国家定量标准品血清、试剂盒对照质控品进行检测，平行进行三组试验，取平均值。
1.4.2 UNG功能性试验2 分别在乙肝病毒HBV DNA核酸扩增PCR荧光定量检测试剂盒反应主混合液中加入0U，0.3U，0.6U，0.9U，1.2U，1.5U的UNG，同时加入模拟污染源的U-DNA模板（10 5 拷贝），对HBV国家定量标准品血清、试剂盒对照平行进行三组试验，对已制备的模拟污染源的U-DNA模板进行功能性试验。平行进行三组试验，取平均值。
1.5 检测方法 血清/血浆标本100μl，采用沉淀富集后直接裂解法。反应体系总体积50μl，其中反应酶混合物（Taq聚合酶2U，尿嘧啶DNA糖基化酶2μl）、PCR反应主混合液30μl、模板量20μl。使用ABI PRISM TM 7700进行PCR荧光检测。反应参数:37℃保温10min后，94℃预变性5min，94℃变性10s，60℃退火60s，共40个循环;荧光信号的收集定为FAM（522nm）、TET（538nm），数据的采集定在60℃。结果判断:采用ABI PRISM TM 7700软件系统计算待测样本含量。
2 结果
2.1 UNG功能性试验1结果 见表1。
从试验结果看出:UNG对U-DNA产物具备一定的消化切割能力，但随着UNG用量的增加会影响试剂盒灵敏度，从表1可看出灵敏度下降。
2.2 UNG功能性试验2结果 见表2。
由试验结果可知:不同浓度的UNG对U-DNA产物及模拟污染源的U-DNA模板切割能力不同，在完全消除污染源又不影响试剂盒灵敏度的前提下，UNG最佳用量为0.6U。此浓度时HBV国家定量标准品血清、试剂盒对照品检测结果与质量标准相关性较好。
2.3 临床标本检测结果 选择0.6U尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）制备反应酶混合物，对乙肝患者、其他肝病患者、健康人群等进行HBV DNA定量检测，其中乙肝HBsAg（+）、HBeAg（+）、HBcAb（+）的患者PCR检出率100%，乙肝HBˉsAg（+）、HBeAb（+）、HBcAb（+）患者检出率72%，其他乙肝标志物阳性标本检出率1.8%，其他肝病患者和临床用血标本无阳性。结果见表3。
表1 不同浓度UNG对HBV国家定量标准品血清进行检测 （copies/ml）（略）
表2 不同浓度单位UNG对模拟污染源的U-DNA模板的检测结果 （copies/ml）（略）
表3 PCR荧光定量检测试剂盒对382份临床标本的HBV DNA检测结果（略）
3 讨论
聚合酶链反应（PCR）是能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。由于其高敏感性也带来了污染的问题，污染来源分为:（1）标本间交叉污染;（2）PCR试剂的污染;（3）PCR扩增产物污染;（4）气溶胶污染;（5）实验室中克隆质粒的污染;其中PCR扩增产物污染是最主要最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量 大（一般为10 13 拷贝/ml），远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳性。
一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染、是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。目前常采取的措施有:实验设计方面 ［6～8］ （1）对照试验法:设立PCR阳性对照和阴性对照;（2）重复性试验;（3）选择不同区域的引物进行PCR扩增;（4）酶法控制。实验室设计要求合理分隔实验室严格划分:（1）标本处理区;（2）PCR反应液制备区;（3）PCR循环扩增区;（4）PCR产物鉴定区;各区用品及吸样枪应专用，实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。实验操作方面要求:（1）加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。（2）预混和分装PCR试剂。（3）PCR试剂、PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。（4）防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、质量好的Eppendorf管并应一次性使用。
在本实验中我们采用尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）消除污染 ［1］ 。UNG对不含dU的模板无任何影响，但UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。所以采用dUTP代替dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR扩增前，这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。由于UNG在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR产物。用HBV DNA血清国家标准品同时构建U-DNA模板对其反应体系进行优化，并应用于乙肝病毒DNA荧光定量PCR检测试剂盒，对382例临床标本进行乙肝病毒定量检测，结果表明合适浓度的尿嘧啶DNA糖基化酶具备一定的防污染能力，同时不影响试剂盒特异性强，灵敏度高，应用方便，与临床具有很好的一致性，更加准确的进行定量。
参考文献
1 P N Rys，D H Persing.Preventing false positives:quantitative evaluation of three protocols for inactivation of polymerase chain reaction amplificaˉ tion products.Clin Microbiol，1993，31（9）;2356-2360.
2 G D Cimino，K C Metchette，J W Tessman，et al.Post-PCR sterilizaˉtion:a method to control carryover contamination for the polymerase chain reaction.Isaacs Nucleic Acids Res，1991，19（1）:99-107.
3 M.Schmidt，B，Frey，K，Kaluza，et al.Application of Heat-labile Uracil-DNA Glycosylase in Improved Carryover Prevention Technique.Bioˉchemic，1996，2:13-15.
4 鲍洪波，王晋芳，钱世钧.尿嘧啶N糖基化酶（UNG）的研究进展.中国生物工程杂志，2003，23（1）:43-47.
5 汤伟，杜绍财，陶其敏，等.抗污染RT-PCR检测HCV RNA的研究.新消化病学杂志，1997，5（10）:638-639.
6 Defilippes FM.Decontaminating the polymerase chain reaction.Biotechˉniques，1991，10（1）:26-30.
7 Schmidt TM，Pace B，Pace NR.Detection of DNA contamination in Taq polymerase.Biotechniques，1991，11（2）:176-177.
8 Sarkar G，Sommer SS.Removal of DNA contamination in polymerase chain reaction reagents by ultraviolet irradiation.Methods Enzymol，1993，218:381-388.
作者单位:471003河南洛阳华美生物工程公司
450052郑州大学化学系化学生物重点实验室