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Zhang Quan，Xu Jingfeng
The266th Hospital of PLA，Chengde，067000.
【Abstract】 Objective The mechanism of physiolling vessol of AS was reserched by the mothed of decting inˉdentical contract range of smooth muscle and the level of cAMP AND Cgmp in rat thoracic aorta.Methods Effects of AS on the concentration-reponse curves for noradrenaline and KCl in rat thoracic aorta were analyzed.Effects of variˉous vasodilators on level of cAMP and cGMP in rat thoracici aorta precontracted with noradrenaline were determined.Results Limping vaso
dilatiry of AS on rat thoracic aorta strips precontracted by noradremaline（1μmol/L）and KCl（30mmol/L）were proved.It’s EC 50 were（35.9±3.1）and（36.7±3.1）μmol/L successively，and EC 50 of nitroˉglycerin were（18.6±3.8）and（18.1±2.2）μmol/L successively.The levels of cGMP in rat thoracic aorta preconˉtracted with noradrenaline were rised by effects of vasodilators of AS（P<0.01）.Conclusion It’s mechanism to physiol artery was:supplying extermal NO · and raising the levels of cGMP in smooth muscle.
Key words AS thoracic artery cAMP and cGMP
早在1933年Thomas lewis就曾指出，亚硝酸酯的作用主要源于其强大的扩张冠状动脉的作用，而非Lauder Brunˉton于1867年在苏格兰提出的是由于其降血压的作用所产生 ［1］ 。近年来，硝酸酯类药物重要的扩血管作用已渐渐被人们所认识。最近研究的重点为EDRF，现被认为是NO · 。在冠状动脉病变时，内源性NO · 生成不足，硝酸酯可提供外源性NO · ，与-SH结合成R·SNO，然后激动血管平滑肌细胞内鸟苷酸环化酶使GTP转化为cGMP，兴奋cGMP-依赖蛋白激酶，改变细胞中各种蛋白质的磷酸化，使肌凝蛋白轻链去磷酸化而产生平滑肌松弛作用 ［2，3］ 。硝酸酯类药物对冠脉及周围血管均有扩张作用。硝酸酯类可扩张大的冠状动脉和直径大于100μm的血管 ［4］ 。本实验对大鼠胸主动脉扩血管机制进行了分子学定位。为该药进行广泛深入的研究奠定了基础，为全面推向临床提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 雄性Wistar大鼠，体重232±11g，购自中国医学科学院实验动物研究所繁育厂，合格证号为SCXK11-00-0006，（2000）第017号，实验二级。
1.1.2 实验试剂、药品 cAMP和cGMP试剂盒购于中国原子能科学研究院。重酒石酸去甲肾上腺素（NE）注射液:武汉制药股份有限公司产品。硝酸甘油注射液（NG）:北京益民制药厂产品。AS:自制。
1.1.3 实验器材 XWTD-164型自动平衡记录仪，上海大华仪表厂产品。504型超级恒温器，上海实验仪器厂产品。GAMBYT-CR型γ计数仪，美国DPC公司产品。MR-1812型高速冷冻离心机，美国JOUAN公司产品。瑞典产LKB-1216型液闪计数仪。
1.2 方法
1.2.1 低渗Krebs液的配制 每升低渗Krebs液中含:NaCl90，CaCl 2 2.2，KCl5.4，MgCl 2 1.0，NaHCO 3 25，葡萄糖5.6mmol，pH调至7.4～7.6。
1.2.2 模型的建立 大鼠颈椎脱臼处死后迅速打开胸膛，靠近心脏处剪取胸主动脉，置于氧饱和的Krebs液中，剥去周围结缔组织后，剪为长10mm，宽2.5mm的螺旋条，放在含有Krebs液20ml的恒温（36.5℃～37.5℃）浴槽中，连续通以95%O 2 +5%CO 2 混合气体，静息负荷为1.3g，反复冲洗，平衡1h。连接肌肉张力换能器，使血管张力与静息负荷高度一致，平衡、换液，再平衡、再换液至血管条收缩高度前后2次基本不变。
1.2.3 NE溶液浓度的确定 在含有低渗Krebs液的浴槽内，加入KCl（30mmol/L），或在含正常Krebs液中加入NE，动脉条均出现快速而明显的收缩，可维持20min以上，调节所给NE的浓度使其收缩高度与KCl所至的收缩高度基本一致，确定NE的浓度为1μmol/L。
1.2.4 血管条收缩实验 往恒温浴槽中加入NE使其浓度达到1μmol/L（或KCl30mmol/L），记录其收缩高度;冲洗，平衡至给药前的收缩水平，重复上述步骤2次（收缩高度前后2次基本不变），待第3次收缩达坪值并稳定后，累计加入NG（0.1～100μmol/L），记录其舒张效应，反复冲洗，平衡至原先高度并稳定后，再加入NE1μmol/L（或KCl30mmol/L）收缩达坪值并稳定后，累计加入AS（0.3～300μmol/L），观察并记录对血管的舒张效应，以NG浓度达100μmol/L的舒张为100%舒张效应，计算各浓度NG和AS松弛效应的百分比。按照Scatchard法计算E MAX 和EC 50 。分别求出NG和AS对NE和高K + 收缩曲线松弛作用的EC 50 值，并计算AS的E MAX 值。
1.2.5 对NE和高K + 量效曲线的影响 浴槽内分别累计加入NE（0.001～100μmol/L）或KCl（10～150mmol/L）至出现最大收缩效应，以此为对照，用Krebs液反复冲洗，平衡，使收缩曲线回到给药前水平，加入AS30μmol/L，稳定10min后再以同法分别作NE和KCl量效曲线，根据Magnus法计算pD 2 ’值 ［5］ 。
1.2.6 对cAMP和cGMP生成的影响 大鼠颈椎脱臼处死，打开胸腔取出胸主动脉条，除去周围结缔组织，每样本称取50mg左右，放在正常的Krebs液中稳定15min，随机分成4组，即空白对照，NE对照，其余各组加入NE1μmol/L10min后再分别加入NG10μmol/L，AS20μmol/L3min后取出，置于2ml50μmol/L冷醋酸缓冲液（pH4.75）中，4℃条件下研磨成匀浆，用2ml无水乙醇制成混悬液，4000×g离心15min，收集上清液，沉淀加入75%乙醇1ml再以4000×g离心15min，合并上清液，在60℃水浴上通以氮气吹干后将残渣于-20℃保存，测量前用1.00ml醋酸盐缓冲液（pH:4.75）溶解，按要求测出cAMP和cGMP水平。
2 结果
2.1 对NE和高K + 预收缩血管的舒张作用 由图2可见，AS呈浓度依赖性地舒张NE和KCl预收缩的血管条。其E MAX 分别为（107.5±11.1）%和（102.7±5.0）%，EC 50 分别为（35.9±3.1）和（36.7±3.1）μmol/L，各浓度AS对NE和KCl预收缩血管的舒张作用强度基本相同（各浓度点P值均>0.05），这一点与硝酸酯类药物NG相似，见图1，后者抑制NE和KCl预收缩血管的作用强度也基本相同（各浓度点P值均>0.05），其EC 50 分别为（18.6±3.8）和（18.1±2.2）μmol/L。
图1 硝酸甘油对去甲肾上腺素和高钾预收缩血管的松弛作用 （略）
图2 阿魏硝胺对去甲肾上腺素和高钾预收缩血管的松弛作用 （略）
2.2 对NE和高K + 收缩血管的量效曲线的影响 加入AS30μmol/L后NE和K + 收缩血管的量效曲线均明显右移，最大反应压低（图3、4）。其pD 2 ’值分别为（3.76±0.06）和（3.98±0.10）。两者各自对NE和KCl预收缩大鼠冠状动脉条松弛效应相似。经t检验除标有“ ☆ ”者（P<0.05）外，各点的P值均<0.01。
图3 阿魏硝胺对去甲肾上腺素量效曲线的影响 （略）
图4 阿魏硝胺对高钾量效曲线的影响 （略）
2.3 对大鼠胸主动脉条生成cAMP及cGMP的影响 NE预收缩血管条的环磷酸腺苷水平与对照组比差异无显著性（P>0.05）。硝酸甘油明显降低cAMP的生成（与对照组比较P均<0.05），阿魏硝胺与硝酸甘油两组间差异无显著性（P>0.05）。
表1 对大鼠胸主动脉条生成环磷酸腺苷的影响 （略）
表2 对大鼠胸主动脉条生成环磷酸鸟苷的影响 （略）
NE预收缩血管条的环磷酸鸟苷水平与对照组比无明显变化（P>0.05）。AS和NG均明显增加cGMP的生成（与对照组比较P值均<0.05），且两组间差异无显著性（P>0.05）。
3 讨论
血管平滑肌细胞内游离Ca 2+ 浓度的变化对血管张力起着重要影响。游离Ca 2+ 浓度升高主要来源于细胞外Ca 2+ 内流和细胞内储Ca 2+ 的释放。目前认为，NE和高K + 分别通过PDC和ROC促使细胞外Ca 2+ 内流进入细胞内，同时NE通过α-受体激活G蛋白与磷脂酶C，产生IP 3 增加，继而引起内质网释放Ca 2+ ，使Ca 2+ 增加而致平滑肌收缩 ［6］ 。NO · 作为细胞信使，介导cAMP生成的增加，发挥生物学作用。血管内皮细胞合成的NO · ，以化学介质形式调节心血管功能，具有血管松弛及抗血小板聚集等作用 ［7］ 。中枢及外周非肾上腺素胆碱能神经产生的NO · ，则作为神经调质和神经递质，起着中枢和外周的调节功能。NO · 供体为一类可释放NO · 的化合物，作为NO · 的运输和贮存形式能延长NO · 的作用时间，产生全身作用 ［8］ 。NO · 生物学与化学特征均与EDRF相似，现已证实NO · 即为EDRF。在化学或血管张力刺激下，血管内皮生成NO · 进入相邻的平滑肌细胞后，cGMP水平升高，激活下游蛋白激酶，最终引起肌球蛋白的氢链去磷酸化，引起血管平滑肌松弛。实验结果 显示:AS和NG相似，对NE和高钾预收缩血管均产生明显松弛作用，表明AS对PDC和ROC均有抑制作用，且EC 50 比较接近，而与维拉帕米等钙拮抗剂不同，后者松弛高钾预收缩血管的作用较强 ［9，10］ 。提示阿魏硝胺不是典型的钙拮抗剂 ［6］ 。本实验测得硝酸甘油对环核苷酸水平的影响与文献报道一致 ［11］ ，所测的阿魏硝胺对环核苷酸水平的影响又与硝酸甘油相符合，升高cGMP水平可能就是阿魏硝胺的主要扩血管机制。
由实验提示，AS和NG均浓度依赖性地舒张NE和高K + 预收缩的血管条，两者各浓度点舒张作用基本相同。AS不是竞争性α-受体阻滞剂，也不是典型的Ca 2+ 拮抗剂。AS通过与血管平滑肌上特异硝酸酯受体的-SH结合，转化为亚硝酸基硫醇和NO · ，进而激活鸟苷酸环化酶，使GTP转化为cGMP，后者通过减少Ca 2+ 进入细胞内或加强肌质网对Ca 2+ 摄取，使细胞内Ca 2+ 减少，从而使血管扩张。
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作者单位:067000河北承德解放军266医院
100700北京军区总医院