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【摘要】 目的 观察黄丹益肾胶囊（HDC）对糖尿病肾病（DN）大鼠肾脏组织病理改变的保护作用。 方法 用链脲佐菌素（STZ）诱发糖尿病肾病大鼠模型，连续给药10周后取肾脏组织进行常规病理组织学检查，并采用碘酸雪夫染色（PAS）免疫组织化学法研究肾小球基底膜厚度、肾组织纤维连接蛋白（FN）表达、肾组织四型胶原（Ⅳ）表达。 结果 高血糖组大鼠均出现DN病理学特征，黄丹益肾胶囊用药组大鼠DN病理学改变明显减轻;肾小球基底膜增厚较模型组对照组小;肾组织纤维连接蛋白、肾组织Ⅳ型胶原表达明显低于模型对照组。 结论 黄丹益肾胶囊对糖尿病肾病大鼠肾脏组织病理改变有良好的保护作用，其机制可能是通过降低FN及Ⅳ表达来实现的。
【关键词】 黄丹益肾胶囊 糖尿病肾病 组织病理学
Effect of Huangdanyishen capsule on renal tissue pathologic alteration on diabetic nephropathy of experimental rats
Nie Youai，Ma Renqiang，Chen Liguo，et al.
Shanxi College of Traditional Chinese Medicine，Taiyuan030024.
【Abstract】 Objective To observe protective effect of Huangdanyishen capsule（HDC）on renal tissue patho-logic alteration（DN）in rats with diabetic nephropathy.Methods The murine models with DN induced by STZ were made from Wistar rats with insulin resistance after fed with feedingstuff of hypersugar，hyperlipid，hypercholesterol.These rats were randomly divided into five groups，and all rats were successively administrated corresponding drugs for10weeks.After the treatment，operated histopathologic examination examination on these rats'tissue，and analyzed thickness of glomerular basement membrane，fibronectin and collagen IV expression of renal tissue.Results The pathological symptom of DN occurred in all model rats.The renal pathological structure，thickening of glomerulose basement membrane and increasing of fibronectin and collagen IV expression in renal tissue were significantly de-creased in HDC by given HDC.Conclusion HDC has obviously protective effect on renal tissue pathologic alteration，its exact mechanism may be due to the decreasing in expression of.fibronectin and collagen IV.
【Key words】 Huangdanyishen capsule diabetic nephropathy histopathology
黄丹益肾胶囊（HDC）由黄芪、丹参等组成，具滋补肝肾，化瘀通络等功效。现根据其功能主治，选用2型糖尿病肾病动物模型，通过对大鼠肾小球基底膜的组织学观察和基底膜厚度的比较，肾组织纤维连接蛋白表达、肾组织Ⅳ型胶原表达的分析。较全面地评价黄丹益肾胶囊对2型糖尿病肾病大鼠肾脏病理组织损伤的保护作用，并对其保护作用的机理作出初步评价，进一步确定黄丹益肾胶囊的药理作用，为临床用药提供药理学依据。
1 实验材料
1.1 药物 受试药物:黄丹益肾胶囊，由广州博济医药生物技术有限公司提供（批号:001211）。对照药物:开博通片，由中美上海施贵宝制药有限公司生产（批号:990813）。1.2 试剂和仪器 链脲佐菌素（streptozoticin，STZ），USA，Sigma公司产品。 125 I-胰岛素放射免疫试剂盒，中国原子能科学研究院提供。胆固醇，由武汉亚法生物技术拓展公司提供。透射电镜，日立H-600型。血糖仪，USA，Medisense公司产品，型号:PrecisionQ.I.D。血糖试纸（批号:4A9）。代谢笼。
1.3 实验动物 清洁级Wistar大鼠，体重180g～200g，由中山医科大学实验动物学部提供（粤检证:2001A029）。
2 实验方法
2.1 造模 筛选血糖在4.2～7.0mmol/L范围的清洁级健康的Wistar大鼠90只，雌雄各半。从入选大鼠中随机挑选10只，雌雄各半，作为正常对照组，给予普通饲料，其余大鼠全部给予高糖、高脂、高胆固醇饲料（含蔗糖10%，猪油10%，胆固醇5%），参照郭啸华、刘志红 ［1］ 方法造模。经高糖、高脂、高胆固醇饲料饲养1个月后，随机抽取15只大鼠，眼眶取血，分离血清，放免检测血清胰岛素含量。同时取正常组作为对照。根据检测胰岛素结果，判断高糖、高脂、高胆固醇饮食的大鼠已经产生胰岛素抵抗。胰岛素抵抗大鼠腹腔注射30mg/kg链脲佐菌素，1周后测血糖，将血糖低于11.2mmol/L的大鼠弃去。保留的大鼠随机分为5组:模型组、8mg/kg开博通组、黄丹益肾胶囊19.4g 生药 /kg、9.7g 生药 /kg、4.4g 生药 /kg三个剂量组。每天给药1次，正常组和模型组大鼠每天给予等量的饮用水，连续给药10周。给药4周后取模型组和正常组大鼠的尿液，进行尿液常规分析，判断模型组肾功能是否受到损害，以进一步确认动物模型成功与否。
2.2 样本采集 给药10周末，迅速脱臼处死大鼠，打开腹腔，取大鼠左肾皮质约0.4cm×0.4cm×0.2cm大小组织块，用4%多聚甲醛固定，做病理组织学检查。
2.3 病理组织学检查 一般组织病理学检查采用HE染色;采用过碘酸雪夫（PAS）染色显示基底膜，纤维连接蛋白（FN）和Ⅳ型胶原免疫组化分析。
2.4 统计学处理 数据以均数±标准差（ˉx±s）表示，所有数据均经计算机统计分析软件SPSS10.0统计软件包处理，组间比较用方差分析。
3 实验结果
3.1 各组大鼠肾脏的病理组织学比较 正常组肾小球大小较一致，包曼氏囊腔清晰可见，肾小球内细胞数目没有明显增多，肾小球毛细血管丛基底膜未见明显增厚。其系膜区、基质未见增生，系膜细胞及内皮细胞未见明显增多。肾小管上皮细胞轻度浊肿，肾间质血管轻度淤血，未见明显炎症细胞浸润，符合正常大鼠处死后肾组织结构特点。模型组:大部分病例肾小球毛细血管基底膜明显增厚，系膜区系膜基质增生，系膜细胞增多，包曼氏囊腔狭窄、闭塞，呈弥漫性肾小球硬化变化，部分病例表现为局灶性肾小球硬化改变。肾小管上皮细胞浊肿，肾间质淤血，可见少许慢性炎症细胞浸润，符合糖尿病肾病病变特征。开博通组:肾组织病变比模型组有所减轻，但均存在不同程度糖尿病肾病特征，大多数病例肾小球毛细血管基底膜仍呈轻至中度增厚，在每一肾组织中有1/2或1/3肾小 球仍保留原有糖尿病肾病肾小球病变特征。黄丹益肾胶囊组:肾组织病变明显减轻改善，半数病例几乎已恢复正常水平，肾小球毛细血管基底膜均匀变薄，清晰可见，系膜区基质减少，系膜细胞无增多。特别是大剂量组对肾组织未见明显毒性损伤作用。
表1 各组大鼠肾小球基底膜厚度比较 （略）注:与正常组比较 ## P<0.01;与模型组比较 * P<0.05 3.2 各组大鼠肾小球基底膜厚度图像分析 通过碘酸雪夫染色，在400倍光镜下用计算机图像分析软件进行统计分析，黄丹益肾胶囊小、中剂量组大鼠肾小球基底膜厚度较正常组显著为厚，与模型组差异无显著性。而黄丹益肾胶囊大剂量组大鼠肾小球基底膜厚度与模型组差异有显著性（见表1及图1）。
图1 肾皮质HE染色结果照片（略）
3.3 各组大鼠肾组织纤维连接蛋白（FN）和Ⅳ胶原表达的比较 结果表明，黄丹益肾胶囊小、中剂量组大鼠肾组织FN和Ⅳ胶原表达与模型组和开博通组均差异无显著性。而黄丹益肾胶囊大剂量组与正常组无差异，与模型组差异有显著性。表明黄丹益肾胶囊保护2型糖尿病大鼠肾功能的作用可能与降低肾小球基底膜FN和Ⅳ胶原表达相关（见表2）。
表2 各组大鼠肾组织纤维连接蛋白表达的比较（略）注:与正常组比较 ## P<0.01;与模型组比较 ** P<0.01
4 讨论
糖尿病肾病（DN）又称糖尿病肾小球硬化症，是糖尿病常见的慢性微血管并发症，其特点以肾小球血管受损、硬化为主。临床主要表现为蛋白尿、肾功能减退，后期可出现尿毒症，已成为终末期肾病的第一病因 ［2］ 。用STZ腹腔注射法诱导糖尿病肾病大鼠模型是目前国际上普遍采用的研究DN的造模方法。本实验按如上方法造模的5组大鼠血糖平均值在21.05～28.16mmol/L，实验结束时模型组尿素氮、血肌酐及尿微量白蛋白含量均比正常组高，充分表明本实验按STZ法造模成功。有研究证实采用亚降压剂量的开博通灌胃可以对STZ法诱导的DN具有肾保护作用 ［3］ 。本实验通过对2型糖尿病肾病大鼠模型和经黄丹益肾胶囊治疗后各组大鼠肾组织进行病理组织学、超微病理学、纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原的免疫组化分析，结果表明:开博通可以降低DN大鼠肾组织Ⅳ型胶原的表达，在一定程度上保护肾组织的结构和功能。同时也从动物实验角度证明黄丹益肾胶囊应用于DN大鼠不仅可以降低DN大鼠肾组织Ⅳ型胶原的表达，而且可以降低DN大鼠肾组织纤维连接蛋白的表达，从而减轻肾小球基底膜的厚度，较好地保护肾脏组织的结构和功能。表明黄丹益肾胶囊应用于DN大鼠具有和开博通相似的肾保护作用，且在改善肾功能和肾脏形态学改变方面较开博通效果更明显。DN的主要病理改变为肾小球基底膜增厚和肾小球系膜增生。肾小球系膜是由系膜细胞和肾小球细胞外基质（ECM）组成，是肾小球重要的结构和功能单位。ECM是围绕系膜细胞的一种非弥漫性固相介质，调节系膜细胞的增生和分泌各种活性物质。在正常情况下ECM的分泌与系膜细胞呈相互制约的关系 ［4］ ，在NIDD中，增高的血糖可以与体内多种蛋白质（胶原蛋白，基质蛋白等）发生非酶催化的糖基化作用，生成糖基化的终末产物（AGE），AGE的集聚使肾小球基底膜支架结构孔径增大，通透性增高，并同时合成多种基质成分如纤维连接蛋白、Ⅳ型胶原等，导致肾小球基底膜的增厚，引发糖尿病肾病 ［5］ 。本实验黄丹益肾胶囊降低DN大鼠肾组织Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白表达的作用是否与抑制AGE的形成有关，有待于进一步研究证实。
参考文献
1 郭啸华，刘志红，李恒，等.实验性2型糖尿病大鼠模型的建立.肾脏病与透析肾移植杂志，2000，9（4）:351-355.
2 林兰.中西医结合糖尿病学，北京:中国医药科技出版社，1999，394.
3 Sugimoto K，Tsuruoka S，Fujimura A.Effect of enalapril on diabetic nephropathy in OLETF rats:the role of an anti-oxidative actine in its protective properties.Clin Exp Pharmacol Physiol，2001，28（10）:826.
4 林兰.中西医结合糖尿病学，北京:中国医药科技出版社，1999，398.
5 王迪浔，金惠铭.人体病理生理学，北京:人民卫生出版社，2002，226-227.
（编辑罗 彬）
作者单位:030024太原山西中医学院
510080广州中山大学中山医学院
510632广州暨南大学医学院