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Affiliated Putou Hospital，Shanghai University of TCM，Shanghai200062，China
【Abstract】 Objective To observe the effect of Changweiqing oral liquid（CWQ）on reversal of mulitdrug resistance and the effect on concentration of DOX（doxorubicin）in tumor and normal tissue.Methods The human oral epider-moid carcinoma cell lines KB-A-1，which were mulitdrug resistance，were injected s.c.into the right flank area of the nude mice，which were randomized into5groups:control group，CWQ group，DOX group，DOX plus CWQ（12.5g/kg）group and DOX plus CWQ（50g/kg）group.The tumor masses were weighted and the tumor inhibition rates were calculated;the concentration of DOX in tumor and normal tissue（livers and kidneys）were analyzed by high performance liquid chromatography;the apoptotic rate of cancer cells were detected by flow cytometry.Results The growth of tumors was not inhibited in DOX and CWQ groups，the weight of tumor masses were all smaller in DOX plus CWQ（12.5g/kg）group and DOX plus CWQ（50g/kg）group than that in other groups.The concentration of DOX in tumor and the apoptotic rate in cancer cell were all higher in DOX plus CWQ group than that in other groups.There were no significant difference between the concentration of DOX in livers and kidneys of every groups.Conclu-sion CWQ can inhibit the growth of tumor and reverse mulitdrug resistance of tumor by increasing the concentration of DOX in tumor，while the concentration of DOX in normal tissues didn't change.
【Key words】 Changweiqing oral liquid;human oral epidermoid carcinoma KB-A-1;mulitdrug resistance
多药耐药（multidrug resistance，MDR）是肿瘤化学治疗提高疗效的最大障碍，许多化疗增敏剂在提高疗效的同时，往往存在严重的毒副作用，限制了临床应用 ［1］ 。许多研究表明，中医药在辅助化疗药治疗恶性肿瘤时，一方面可增强化疗药的治疗效果，另一方面可减轻化疗药的毒副作用，其机制尚未被完全阐明，是否对肿瘤组织和正常组织中化疗药分布有不同的影响尚未见报道 ［2］ 。我们既往的研究表明，中药复方肠胃清口服液可抑制移植瘤的生长，并可明显提高小鼠脾脏及胸腺指数 ［3］ ，本研究建立多药耐药移植瘤模型，重点观察肠胃清对化疗药的增效作用，以及对瘤组织和正常组织中化疗药分布的影响，阐明肠胃清增效减毒的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料 细胞株:KB-A-1是人口腔表皮癌耐药细胞系。此细胞株由Ira Pastan博士和Micheal.M.Gottesman博士馈赠（National Institutes of Health，USA）。细胞置于培养箱，在37℃，5%CO 2 +95%空气条件下培养。培养基为DMEM，加入10%小牛血清，加入氨苄青霉素、硫酸链霉素至终浓度各100u/ml，培养基中加入1.0μg/ml阿霉素（dox-orubicin，DOX）。动物:BLAB/c nu/nu裸小鼠，雄性，4～6周龄，由中国科学院上海实验动物中心提供，按照SPF条件饲养。肠胃清口服液由黄芪、党参、白术、石见穿、野葡萄藤等药物组成，由上海中医药大学附属普陀医院制剂室提供，生药浓度为1.33g/ml。
1.2 人表皮癌细胞KB-A-1异种移植模型的建立 ［4］ 单层培养细胞用胰蛋白酶消化，用PBS悬浮混匀至约3×10 7 cells/ml，以5×10 6 cells/0.2ml浓度皮下注射接种于裸小鼠右侧腋下，3周后，处死动物，迅速将肿瘤组织解剖下来，剪碎，通过网筛过滤，用PBS吹打成2×10 7 cells/ml细胞悬液，以2×10 6 cells/0.1ml浓度皮下注射接种于裸小鼠右侧腋下，当肿瘤组织生长到5mm×5mm大小时开始给药处理。
1.3 动物分组及治疗方法 将上述长有肿瘤的裸小鼠随机分为5组，每组6只，分别是:①空白对照组:注射生理盐水（腹腔注射），每天1次;②肠胃清组:（50g/kg，每天1次灌胃，第1～9天给药）;③DOX组:（2mg/kg，腹腔注射，每天1次，第2、4、6、8天给药）;④DOX+低浓度肠胃清实验药物组:（肠胃清为12.5g/kg，给药方案同②组;DOX的给药方案同③组）;⑤DOX+肠胃清高浓度实验药物组:（肠胃清为50g/kg，给药方案同②组;DOX的给药方案同③组）。
在DOX和肠胃清同时需要给药日，肠胃清腹腔注射后5h再腹腔注射DOX。每隔3天称量1次体重，并记录对动物的行为观察。全部动物在给药处理后18天时用乙醚麻醉后处死，迅速取出肿瘤称重。
1.4 肿瘤和正常组织内DOX浓度的测定 通过HPLC分析，对肿瘤、肝脏和肾脏内的DOX浓度进行定量测定，以确定肠胃清对DOX在被移植肿瘤的裸小鼠体内的分布的影响。具体实验步骤如下:在装有0.02M KH 2 PO 4 缓冲液（pH3.8）中，将取出组织以1:5W/V比例充分匀浆，加入30μl KH 2 PO 4 、60μl33%AgNO 3 、40μl内标（柔红霉素，daunoru-bicin）和390μl80%乙腈水溶液至300μl组织匀浆液，旋涡振荡2min以混合均匀，3000rpm，4℃离心10min以沉淀蛋白质，去100μl用于HPLC分析，HPLC体系为:荧光检测器，激活波长495nm，发射波长560nm;固定相为C18反相柱（5μm，安捷伦）250mm×4.6mm;流动相为5mM磷酸/甲醇/异丙醇/乙腈（8:7:3:2，体积比）;流速为0.7ml/min。每个样品测定3次，取平均值.数据以DOX峰面积与内标峰面积的比值表示，计算出组织内的DOX浓度。
1.5 肿瘤组织内凋亡的检测 肿瘤组织被称重后立即置于10ml预冷的PBS（含有0.2%牛血清白蛋白、0.01mol/l EDTA和10mg/ml脱氧核糖核酸酶I（deoxyribonuclease I）剪碎组织，在玻璃匀浆器中充分匀浆，缓慢通过40μm孔径尼龙膜，过滤，滤过的液体以500×g，在室温下离心10min，用500μl含有BSA的PBS吹打沉淀成为细胞悬液，转移至新的Eppendorf管中，用预冷的70%乙醇（溶解于PBS）在4℃固定8h，加入RNase（终浓度为20μg/ml）在37℃温育30min，用终浓度为50μg/ml的碘化丙锭（propidium iodide，PI）染色，使用FACS Calibur流式细胞仪检测DNA含量，CELLQUEST软件分析数据并作图，亚二倍体峰被定量，作为测定凋亡的标准。
1.6 统计学方法 数据以平均值±标准偏差表示，通过t检验和ANOVA检验分析。P<0.05被认为具有统计学意义。
2 结果
2.1 肠胃清对体内MDR肿瘤的增殖抑制作用 研究结果如表1所示，DOX和肠胃清分别单独给药治疗均不能抑制肿瘤组织的生长，它们的瘤重抑制率分别只有4.55%和3.15%。与此相对，DOX与肠胃清联合给药治疗则能够显 著减少肿瘤组织的重量，瘤重抑制率接近50%，经统计学处理差异有非常显著性（P<0.01）。
表1 肠胃清对耐药性KB-A-1细胞移植瘤针对阿霉素的增敏作用 （略）
2.2 肠胃清对肿瘤和正常组织中的阿霉素浓度的影响 结果如图1所示，DOX与肠胃清联合给药组的肿瘤组织内的DOX浓度比DOX单独给药组的高61%（P<0.01）。在DOX单独给药组和DOX与肠胃清联合给药组中，肝脏和肾脏组织内的DOX浓度均没有明显变化（P>0.05）。
图1 肠胃清对肿瘤、肝脏和肾脏中的DOX浓度的影响（略）
1，肿瘤组织;2，肝脏;3，肾脏（** P<0.01）
2.3 肠胃清对肿瘤组织中阿霉素诱导凋亡的增强作用 如图2，3所示，肠胃清和DOX均能诱导肿瘤细胞的凋亡，与对照组相比差异有显著性（P<0.05或P<0.01），肠胃清与DOX联合给药组的凋亡水平明显增高，比DOX单独给药组高175%（P<0.01）。
图2 流式细胞仪对小鼠体内的肿瘤细胞的Apoptosis的分析（略）
图3 流式细胞仪对肿瘤组织中的凋亡水平的定量分析（略）
0，空白组;1，肠胃清组;2，Dox组;3，Dox+肠胃清组（* P<0.05，** P<0.01）
3 讨论
通过建立人表皮癌细胞异种移植模型，我们对肠胃清在体内逆转MDR的效应进行了评价。DOX和肠胃清分别单独给药治疗均不能抑制肿瘤组织的生长，它们的瘤重抑制率分别只有4.55%和3.15%。与此相对，DOX与肠胃清联合给药治疗则能够显著减少肿瘤组织的重量，瘤重抑制率接近50%。结果显示DOX与肠胃清联合给药后能够有效地逆转体内肿瘤细胞的MDR表型。
MDR细胞的一个显著特点就是:肿瘤细胞内的抗癌药物浓度水平很低，而且这些药物的流出速率比敏感性细胞快。MDR的肿瘤细胞就是通过提高药物流出的速度和降低药物流入细胞的速度，使细胞内实际作用的抗癌药物浓度显著降低，从而减弱了抗癌药物在细胞内的细胞毒性作用 ［5］ 。因此，耐药性细胞KB-A-1的多药耐药性是与胞内的抗肿瘤药物浓度降低直接相关的。为了研究肠胃清在体内逆转肿瘤MDR的作用机制，通过HPLC定量分析，我们考察了肠胃清对裸小鼠体内的肿瘤组织中的DOX浓度的影响。研究表明DOX与肠胃清联合给药组的肿瘤组织内的DOX浓度比DOX单独给药组高61%，这一结果表明，肠胃清能够在体内显著增加耐药型肿瘤细胞KB-A-1对抗肿瘤药物DOX的敏感性。 在以往的研究中，人们发现很多MDR逆转剂在临床试验中表现出严重的毒副作用如心脏毒性，或者增加抗肿瘤药物引发的对正常组织的毒性作用。因此，为了考察肠胃清是否会增加DOX对正常组织的毒性作用，我们同时还检测了肝脏和肾脏组织（作为正常组织的代表）内的DOX浓度。实验结果表明，在DOX单独给药组和DOX与肠胃清联合给药组中，肝脏和肾脏组织内的DOX浓度都没有明显变化。这一发现提示，在被移植肿瘤的小鼠体内，肠胃清似乎没有增加DOX所引发的对正常组织的毒性作用。
作为常用化疗药物的DOX，在一个较低的浓度下，具有诱导凋亡的细胞毒性作用，其作用机制是DOX分子结构的平面部分嵌入到DNA的双链中形成稳定的复合物，影响DNA的结构和功能，阻止DNA复制和RNA的合成，还能抑制拓扑异构酶Ⅱ的功能，从而抑制肿瘤细胞的分裂和增殖 ［6］ 。我们采用流式细胞仪的方法定量测定了肿瘤细胞的DNA含量的变化，以亚二倍体的峰作为凋亡的标准。说明肠胃清能够增强DOX的细胞毒性作用，诱导肿瘤细胞发生凋亡。肠胃清的这种化学增敏作用与我们观察到的肿瘤组织内的DOX浓度增加的结果是一致的，进一步说明肠胃清通过增加DOX在肿瘤细胞内的积累而增强了DOX的细胞毒性，从而抑制了肿瘤组织的生长，导致瘤块重量显著减少，耐药性得以被逆转。
【参考文献】
1 Thomas H，Coley HM.Overcoming multidrug resistance in cancer:an update on the clinical strategy of inhibiting p-glycoptotein.Cancer Control，2003，10（2）:159-165.
2 侯丽，陈信义.中医药逆转肿瘤多药耐药特性与前景分析.中国中医基础医学杂志，2004，10（4）:79-81.
3 许建华，李朝衡，朱美华，等.肠胃清口服液抗肿瘤作用研究.中药药理与临床，2004，20（4）:42-43.
4 Zhang Q，Wei D，Liu J.In vivo reversal of doxorubicin resistance by（-）-epigallocatechin gallate in a solid human carcinoma xenograft.Cancer Letters，2004，208（2）:179-186.
5 Salama NN，Eddington ND，Payne D，et al.Multidrug resistance and anticonvulsants:new studies with some enaminones.Curr Med Chem，2004，11（15）:2093-2113.
6 Mizutani H，Tada-Oikawa S，Hiraku Y，et al.Mechanism of apoptosis induced by doxorubicin through the generation of hydrogen peroxide.Life Sci，2005，76（13）:1439-1453.
作者单位:200062上海，上海中医药大学附属普陀医院消化内科（△ 中医肿瘤科）